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RAPD指紋標記應用於台灣本土塘虱魚品種鑑別

農業委員會水產試驗所淡水繁養殖研究中心 黃家富
國立臺灣海洋大學水產養殖學系 陳昭德

一、前言

  台灣地處於亞熱帶,島內多山,形成河川流短而急促;但仍擁有70餘種之原生淡水魚,以及百餘種以上的洄游及河口型魚類,使臺灣成為全世界單位面積淡水魚種類最高的區域之一。然而幾十年以來,由於工業及電子等現代科技發展,使人類社會物質文明達到另一高峰,但相對的導致生態環境惡化、自然資源與能源過度消耗。另外,由於一昧著重農業經濟的發展,致忽略維護種原的認知與共識,再加上人為的濫捕與經濟利益掛帥心態驅使,恣意的引進外來種,導致本土性魚種有日趨滅絕之虞。本會水產試驗所(水試所)有鑑於本土性魚種生物多樣性研究之重要性及籌設水產種源庫之需,乃與國立臺灣海洋大學合作,積極的建構DNA指紋分子標記技術平台,期能瞭解本土原生種魚種的遺傳資訊,達到保種的目標,進而利用在未來選種及育種工作上。

二、DNA分子鑑定技術

  俗語說:「龍生龍、鳳生鳳,老鼠生的兒子會打洞」,此俚語說明了物種親源的關係,更闡明基因(DNA)的重要使命;DNA是生傳遞遺傳訊息的物質,它存在於生物的細胞中,以密碼形式儲存著遺傳訊息資料,直接反應生物個體或種群間基因組中DNA片段間的差異,產生與生俱來的DNA分子標誌,此標誌常被作為生物族群遺傳、親緣鑑定、遺傳標記等研究之用,這種DNA分子標誌便稱為DNA指紋分子標記。目前常用的DNA指紋分子標記技術有:(1)粒線體DNA序列分析、(2)隨機擴增片段多形性 (RAPD)、(3)擴增片段長度多形性(AFLP)、(4)重複序列標記–微衛星DNA (Microsatellite DNA)、(5)表達序列標幟 (EST)等。水試所係以RAPD核苷酸標記技術評估台灣本土原生種塘虱魚的遺傳變異情形。

  所謂RAPD分析原理係利用不同的隨機排列的10個鹼基 (bp)寡核苷酸單鏈為「引子」(primer),以目標生物的基因組DNA為模板 (Temprate)進行PCR擴增反應,然後依反應產物 (DNA片段)的電泳圖譜多形性來進行遺傳資訊分析。RAPD分析方法最大的優點在於操作簡便、分析量大,只需少量的樣品DNA、經PCR反應可複製特定的DNA產物,不必使用放射性同位素,可以直接進行膠體電泳觀察結果。

三、RAPD應用於塘虱魚品種鑑別

  本研究乃運用RAPD技術分析臺灣本土性塘虱魚、非洲塘虱魚及泰國種塘虱魚等三種塘虱魚的遺傳變異。以John B. H.設計之RAPD primer oligonucleotide set No. 101-300共200組為引子進行試驗,篩選得16組引子產生可重複的DNA圖譜(如圖一 DOCX / pdf),依據該DNA片段代表基因座共享的方法分析遺傳變異性,顯示單個引子產生RAPD標記數平均在7.18–9.62個表現分子DNA片段條帶;其擴增DNA片段分子大小介於300–2000鹼基對(bp)之間。隨機擴增多形性核苷酸圖譜顯示三種不同種塘虱魚甚至於不同水域捕獲的台灣本土性塘虱魚,皆顯示不同層次的多形性。經分析顯示,來自頭前溪和高屏溪的台灣本土性塘虱魚的遺傳多形性分別為58.44﹪及40.85﹪,人工育種之台灣本土性塘虱魚遺傳多形性為58.12﹪。三個不同來源之本土性塘虱魚 (新竹頭前溪、高雄高屏溪及私人種苗培育場)的遺傳異質性 (Heterozygosity)估計分別為0.467、0.311及0.445,此意謂著生存於自然水域中的台灣本土塘虱魚之數量可能處於族群衰減 (population decline)狀態。分析台灣本土性種塘虱魚、非洲塘虱魚及泰國塘虱魚三種品種間之遺傳相似係數(F),台灣本土性塘虱魚對非洲塘蝨魚及泰國塘虱魚之F值分別為0.6646及0.5879;又分析三個不同來源之台灣本土性塘虱魚的種內遺傳相似係數則分別為0.9296 (頭前溪vs高屏溪)、0.8163 (頭前溪vs人工種苗)及0.7659 (高屏溪vs人工種苗)。依據遺傳相似性係數(F)估算,頭前溪與高屏溪的塘虱魚具93﹪相似度,若與非洲塘虱魚比較只具66﹪相似度,與泰國塘虱魚比較僅具59﹪相似度,顯示台灣本土性塘虱魚的基因庫尚未因棲息地破壞或雜交種競爭而嚴重受到擾亂。

  此外以編號# 211、# 245、# 287之引子對非洲塘虱魚染色體DNA進行PCR反應,分別將核核苷酸如圖二 DOCX / pdf)譜中之特定DNA片段回收作為探針 (probe),以此探針對不同來源之塘虱魚進行雜合 (hybridization)試驗,結果證明了作為探針的DNA片段確實僅存在於非洲塘虱魚染色體DNA中。也利用此特定探針對頭前溪、高屏溪、苗栗明德水庫、人工種苗、非洲塘虱魚與台灣本土性塘虱魚雜交子代及福馬林標本等塘虱魚樣品進行雜合試驗,結果只有苗栗明德水庫水域之塘虱魚樣品與人工雜交子代可與探針呈現反應,證實了RAPD遺傳標記會遺傳到雜交子代的理論,同時建立塘虱魚的RAPD遺傳標記。

四、未來展望

  生物多樣性之保護與永續利用是維持全球經濟穩定與發展的重要因素。然而以外表型態差異來揭示物種變異性的傳統分類學研究,其焦點僅著於物種的層次上,無法深入探究生物多樣性之意涵,更遑論保護與永續利用,因此,應用DNA分子層次來建立鑑定生物多樣性的技術,已成為當前必備的要件。水試所因應國內〝水產種源庫之建立〞,積極建立DNA指紋分子標記技術平台,將其廣泛應用於水產(1)物種鑑定,(2)族群遺傳結構分析,(3)重要特性遺傳標記之建立,(4)育種選種,及(5)確立品種智慧財產權等各項鑑定及研究工作上。

  

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