一、前言

　　本研究室近20年來從事動物DNA鑑識之研究，其中利用DNA指紋技術，發現很多動物之種別及性別DNA分子標記，可以利用簡單的PCR操作及電泳，快速、準確的予以鑑定。素食不能摻雜動物原料、為防止狂牛症蔓延飼料不能添加肉骨粉、回教徒不吃豬肉、高價鴕鳥肉不能以較廉價之鴯鶓肉或牛肉混充，這些問題可以利用種別DNA標記鑑定解決。有的動物從外觀不容易判定性別，但配種、買賣時需要確切知道性別，性別DNA分子標記的鑑定可以解決這個問題。本文將針對本研究室開發之快速、準確的動物DNA分子鑑定性別技術與應用作介紹。

二、DNA分子鑑定技術鑑定動物性別之必要性

　　動物性別之鑑定無論是經濟動物生產效益或寵物買賣等皆有其實質之必要性，而且是越早越好，對畜產業之經濟生產業而言性別更是重要，此乃因性別之差異，在飼養管理、市場的價格及經濟收益亦有差異。選性繁殖有其經濟上之價值。例如公乳牛不會產乳，母的才會產乳。又如雞蛋生產者只飼養雌性雞隻生蛋，至於雄性雞隻一孵化出來便予淘汰，以免只吃飼料而不下蛋。另在鳥類方面，基於配種或買賣上之需要，性別之分辨有其實益。若以鴕鳥與鴿子性別之鑑定為例來說明，輸入「鴕鳥性別」、「鴿子性別」的關鍵字利用Google搜尋，所採用之方法均是從外觀分辨其性別，惟大部分的鳥類雌雄外形非常接近，不易準確從外表判斷性別；如果利用侵入性的方法，如外科解剖，除了造成鳥類傷亡之外，在非生殖季時因生殖腺萎縮，亦難以判定其性別。

三、性別鑑定技術的發展及其應用

　　動物性別在受精時即已決定，哺乳動物之性染色體，雌性為XX，雄性為XY。鳥類之性染色體，雌性為ZW，雄性者為ZZ。性別對動物的生長發育、疾病感受性、外在形態與生態特性有重大關聯。近年來發展迅速的哺乳動物性別控制技術包括針對精子及埋植前胚胎兩種性別鑑定系統。在精子性別鑑定方面有Barr-body鑑定技術、percoll density gradient 遠心分離法、laminar flow fractionation 流體分離法、free-flow電泳法、流動細胞測定儀（flow cytometry）來分離帶有特殊染色體的精子，惟尚無法準確的達到選性繁殖之目的。如果利用胚分切與胚移置，配合DNA分子鑑定性別技術，則可達到控制後代性別的目的。日本荷蘭種牛登錄規程規定：「異卵異性雙胞胎需經產仔後始能登錄，但經鑑定為非Freemartin者不在此限。」；台灣荷蘭種乳牛登錄辦法實施細則亦規定「異性雙胞胎牛，俟該女牛分娩後始得辦理登錄，但經親子鑑定或基因比對證明不是雌性雄相體者不在此限。」。異性雙胞胎牛，是否為雌性雄相體，如果利用DNA分子鑑定技術，性別即可判別，毋須俟該女牛分娩後再決定是否能辦理登錄。惟雖然早期鳥類性別研究，除了以行為、外形、音頻或築巢行為的生態判斷外，利用細胞染色體差異來鑑定鳥類性別也被研究，然而這些方法皆無法普遍且準確的判斷各種鳥類的性別。一直到1990年代Griffiths利用一種DNA分子鑑定技術來判定鳥類性別後，鳥類研究有了新的發展。目前世界上利用DNA分子鑑定技術鑑定哺乳動物或鳥類之性別，已有商業上的鑑定用套組販售(圖1、圖2   DOCX / pdf / odt)。

四、DNA分子鑑定性別技術之建立

　　動物性別鑑定的重要性及利用傳統外觀方法分辨性別的缺點已如前述。顯示開發快速、且準確率達100%的鑑定方法極為必要。DNA分子鑑定性別技術的開發就能達成這個目的。

　　近年來，性染色體DNA序列的發現，加上DNA增殖技術的研發，各種動物包括胚埋殖前之性別鑑定準確率大為提高，而由於鑑定時間縮短及分析方法簡化，此項技術上的突破，對於傳統性別鑑定方法造成極大的衝擊。在DNA層次的性別鑑定，研究者可以利用包括逢機增殖多態性DNA（RAPD）、逢機增殖微衛星多態性指紋（random amplified microsatellite polymorphisms, RAMPO）及增殖片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）等方法，從DNA指紋中出現的性別特異環帶進行性別鑑定。

　　RAPD的好處是不必刻意設計一對特殊的寡核苷酸引子，來增殖一特異標的序列。它是使用單一的、短的逢機寡核苷酸引子增殖基因組逢機DNA序列，因為引子很短較容易煉合到許多不同的基因座上。如有引子煉合之方向正確，而且其間的距離恰當，即可在複雜的DNA模版上增殖出片段。一般RAPD所使用的引子皆只有9－10個核苷酸長，至少含有50% 的G和C。產物可以輕易經由標準的電泳技術而分離及判讀。多態性之結果是來自引子煉合位置序列之改變，不同個體間的遺傳組成不同，引子之煉合處即不相同，因而增殖出的DNA片段也就不同，諸如點突變即會妨礙標的位置與引子之煉合，或者序列之改變而妨礙了逢機引子的增殖。其他如倒置、缺失、重複、易位及插入等染色體結構改變皆會影響引子煉合位置。此種多態性被當作顯性的遺傳標記，且是依孟德爾定律的方式遺傳。使用RAPD法進行性別鑑定，需要費力去找尋可用的引子，RAPD指紋環帶分布有時會受到諸如PCR儀器、反應物質、反應條件或操作者之影響。

　　RAMPO指紋技術是結合了RAPD指紋與微衛星重複序列探針雜交之技術，先將基因組DNA以逢機引子增殖後，再將PCR產物於膠體中電泳，轉漬至尼龍膜中，再利用放射性同位素或螢光物質標幟之重複序列探針進行雜交，經自動放射顯相後，即可在X光片上呈現多態性的RAMPO指紋。亦可將PCR產物以限制酶切割再進行電泳及南方吸漬雜交，建立RAMPO指紋。例如可利用逢機序列之寡核苷酸為引子，增殖不同性別荷蘭種乳牛基因組DNA，產物行膠體電泳後，將膠體上之片段轉到尼龍膜上，再與微衛星重複序列（TG）6探針雜交，會發現RAMPO指紋中，雄性荷蘭乳牛者皆可出現一特異環帶，雌性牛則無，因而可知此環帶與Y染色體連鎖，可為性別判定之標記。

　　AFLP方法則為先利用限制酶切割基因組DNA，再利用轉接子與切割片段接合，即可利用與轉接子序列互補的引子進行嚴苛的PCR。PCR產物再進行電泳，然後再利用自動放射顯影或螢光序列分析儀分析多態性的指紋態樣。因此可不需事先知道基因組序列訊息，亦可不必利用探針，只需應用與轉接子序列互補的引子即可得到增殖產物。將雌、雄AFLP指紋相互比對，找出性別特異標記。由於在實際操作上，AFLP技術需經限制酶切割、轉接子接合、PCR增殖、電泳分離與顯影分析等繁雜步驟，故用此法進行的性別鑑定者仍然相當少。

　　本研究室建立之DNA分子鑑定動物性別技術，是先建立DNA指紋，找出雌性或雄之特異環帶，分辨出雌雄性別。我們並不以此為滿足，進一步將DNA指紋中雌性或雄之特異環帶的DNA純化出來，構築入質體中，然後以雙去氧核苷酸序列分析法加以定序，再依據雌性或雄之特異環帶的DNA序列設計引子，以動物之基因組DNA為模板，以利簡單的以PCR增殖出雌性或雄之特異環帶，電泳後就可鑑定出動物之性別。這個方法的好處是操作簡單、快速且準確率達100%。本研究室以利用此一方式，陸續建立多種動物之DNA分子鑑定性別技術(圖3 DOCX / pdf / odt)。這些選殖出來之雌性或雄之特異序列，經上網與世界上前人發表之序列比對，發現均為前人所未發現之新序列，故應可歸屬專利法中所謂之新發明。這些DNA分子鑑定動物性別技術，由於相當具有市場上之實用性，已提出專利申請，有的已獲專利許可，有部分案件尚在審核中。

五、未來展望

　　鑑定動物性別，毋需昂貴設備、操作簡單、快速、準確率達100%是基本要求，惟有如此才可能具有市場普及性與競爭力。本研究室開發之DNA分子鑑定動物性別技術，在設備需求方面，除了一般實驗室通常基本的離心機、電泳設備外，僅需一台價值新台幣十餘萬元之PCR儀就可進行，毋需昂貴設備。上述鑑定動物性別所需之引子、反應條件本研究室均已建立，僅需進行簡單的PCR增殖及將增殖產物電泳，性別立判，整個過程至多5小時內應可完成。所以不但操作簡單、快速，且準確率可達100%。供試樣品可來自血液、組織、胚等。為了方便樣品之採集及運送，在鴕鳥方面，本研究室接受業者將鴕鳥羽毛裝入信封，以郵寄方式寄來鑑定，結果成功的鑑定出性別，並將鑑定結果通知業者(圖4、圖5 DOCX / pdf / odt)。這種鑑定模式的好處是實驗室無須派人到現場採樣(尤其對已長大的鴕鳥採血相當不容易)，業者可隨時視需要寄送樣品，確屬方便、經濟又節省人力。其他動物將來亦擬比照辦理。將來本研究室擬依動物別，利用已開發之技術，組合各種動物之性別鑑定套組。使用簡易的方法及設備，就可鑑定動物的性別，這些套組成本很低，深信該產品在世界上會有相當大的市場潛力。