家畜衛生試驗所 陳姿菡

一 . 前言

　　口蹄疫（ Foot and Mouth Disease; FMD ）為偶蹄類動物之高度傳染性疾病，主要感染牛、羊及豬等經濟動物。口蹄疫病毒（ FMDV ）是正股 RNA 病毒，在 Picornaviridae 中隸屬於 Aphthovirus 屬。此疾病在臨床診斷上仍無法與豬水疱病（ Swine Vesicular Disease; SVD ）、水泡性口炎（ Vesicular Stomatitis; VS ）、豬水泡疹（ Vesicular Exanthema; VE ）及海獅病毒（ San Miguel sea lion virus ）等作有效的區別。目前我國針對牛、羊及豬等動物已全面施打口蹄疫不活化疫苗作為防疫的手段，而口蹄疫不活化疫苗在製造中已排除非結構蛋白成分，因此只會產生結構性蛋白抗體，並不會產生非結構蛋白 （ Non-structural protein; NSP ） 抗體，只有感染口蹄疫病毒的動物，才會有口蹄疫 NSP 抗體的產生。依據世界動物衛生組織（ OIE ） 2009 年出版之陸生動物診斷試驗及疫苗標準手冊所建議，檢測口蹄疫 NSP 抗體的方法有間接型酵素連結免疫吸附法（ Indirect enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA ）及酵素連結免疫電泳轉漬法（ Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay; EITB ）等二種，故血清學監測也是篩檢感染口蹄疫之可靠工具。而目前國內檢測豬口蹄疫 NSP 抗體係採用包括美國 UBI （ 3B ）、美國 Chekit （ 3ABC ）及荷蘭 Ceditest （ 3ABC ）等三種商品化 ELISA 套組，而此三種套組分別以合成的 Peptide 或以大腸桿菌（ Escherichia coli ）或昆蟲桿狀病毒（ Baculovirus ）所生產之重組蛋白，作為基質製造的間接型（ Indirect ）及阻斷型（ Blocking ）等口蹄疫 NSP 抗體檢測 ELISA 套組，用來檢測血清中之 NSP 抗體，以作為區別自然感染與疫苗免疫的例行性血清學監測方法。

二 . 技術研發

　　由於科技日新月異，國際上已成功開發之快速且準確可檢測口蹄疫 NSP 抗體之方法計有膠體免疫擴散法、微珠（ latex bead ）凝集試驗、酵素連結免疫電泳轉漬法（ EITB ）、酵素連結免疫吸附法（ ELISA ）、多樣性 Luminex 檢測法（ xMAP ）、免疫色層分析測試片（ Chromatographic strip ）等方法，這些檢測方法均須符合一致化和標準化。而各種方法所選擇口蹄疫 NSP 抗原包括 2B 、 2C 、 3A 、 3B 、 3ABC 和 3D 等蛋白，這些抗原多使用原核表現系統（ Escherichia coli ）或真核表現系統（ Baculovirus ）所生產。

　　本所針對台灣口蹄疫病毒分離株 O/TW/97 或 O/TW/99 之 NSP 抗原決定位，以原核表現系統（ Escherichia coli ）進行重組蛋白表現，並製作該等蛋白之 單株抗體，利用單株抗體的高專一性及重組蛋白易量產的優勢， 建立三明治酵素連結免疫吸附法（ Sandwich ELISA ）的檢測方法， 據以開發 具敏感且可靠之 ELISA 試劑套組， 對豬隻血清抗體進行定性與定量的檢測（圖 1 ）， 以有效達到區別口蹄疫自然感染與疫苗免疫所生成之抗體。

三 . 試驗結果

　　為了評估本所所開發之口蹄疫病毒 O 血清型非結構蛋白抗體 Sandwich ELISA 檢測方法的準確性及敏感性，我們使用 770 支各種不同來源之豬血清樣品進行測試，藉以建立 Sandwich ELISA 方法之最適反應條件，俾便穩定測試之品質控制及血清測試結果。本 Sandwich ELISA 方法經二重複的測試顯示，本方法之特異性可達 100% ，而敏感性約達 98.4% ，且本方法比同樣以 Escherichia coli 系統表現之重組蛋白所製成的商品化試劑套組之敏感性高達 2.8 倍。

　　另再以 32 頭攻毒試驗豬隻於感染後第 0 至第 34 天分別連續採樣所得 320 支口蹄疫陽性血清，分別以本 Sandwich ELISA 方法及商品化 ELISA 試劑套組（ A 、 B 、 C 組）進行比較，顯示，本 Sandwich ELISA 方法及商品化 ELISA 試劑套組（ A 、 B 組）於豬隻感染口蹄疫病毒後第 8 天，即可檢測出 NSP 抗體，而於感染後第 14 天 NSP 抗體的檢出率達到最高峰（圖 2 ），且本方法與 ELISA （ A 組）之統計分析 Kappa 值為 95% ，其符合率達 97.5% 。

　　此外，由於國內發生的口蹄疫屬 O 血清型，為了評估本 Sandwich ELISA 方法是否可以檢測其他血清型的抗體，我們分別使用感染口蹄疫病毒 A 、 C 、 Asia1 、 SAT1 、 SAT2 及 SAT3 等不同血清型的牛隻陽性抗血清進行本 Sandwich ELISA 方法的測試，結果均可檢出口蹄疫非結構蛋白抗體，因此本方法的檢測範圍並不侷限於口蹄疫 O 血清型病毒的感染，也能檢測口蹄疫其他六種血清型病毒的感染。另一方面，本方法也以豬水疱病（ SVD ）與水泡性口炎（ VS ）的陽性抗血清進行測試，證實本方法對於口蹄疫病毒以外的水疱性疾病病原所誘發的抗體不會產生交叉反應，顯示本方法之反應特異性。

四 . 檢驗套組之應用及開發潛力

　　口蹄疫病毒非結構蛋白（ NSP ）抗體的檢測，已列入世界動物衛生組織（ OIE ）動物衛生法典中口蹄疫清淨化必須檢測項目之一，作為區別口蹄疫自然感染與疫苗免疫之抗體檢測方法。因為經口蹄疫疫苗免疫的動物不會產生 NSP 抗體，只有感染口蹄疫的動物才會產生，因此對於以施打口蹄疫疫苗作為控制策略的國家，使用具準確性及敏感性的 NSP 抗體檢測方法，方能即時自免疫動物群中發現及摘除疑似感染的陽性動物。本所所開發的口蹄疫 NSP 抗體三明治酵素連結免疫吸附法（ Sandwich ELISA ），媲美於既有之商品化檢測套組，未來將實際應用於實驗室例行樣品之檢測，以期快速有效且明確地鑑定出感染過口蹄疫病毒的偶蹄類動物。

　　由於本所開發之口蹄疫 Sandwich ELISA NSP 抗體檢測方法，係以生物技術設計的原理研發而成，故完全符合生物安全的需求，無需特定設施之實驗室即可進行檢驗與操作，不僅提高檢測之廣度，又由於能檢測口蹄疫七種不同血清型病毒的感染，且不會與口蹄疫病毒以外的水疱性疾病病原所誘發的抗體產生交叉反應，因此對檢測之深度也明顯有加分效果。另一方面，由於 重組蛋白量產技術已成功建立，更有利於 本 Sandwich ELISA 方法的推廣。

圖 1 口蹄疫非結構蛋白抗體檢測 Sandwich ELISA 的應用原理

圖 2 口蹄疫陽性血清樣品分別以 Sandwich ELISA 及商品化 ELISA 試劑套組（ A 、 B 、 C ）之動力學比較結果