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日本家蠶分子牧場研發及應用概況

苗栗區農業改良場 盧美君

  自 Watson-Crick 於 1953 年發現 DNA 結構以來,生物科技之發展日新月異,進展神速,加上近十幾年來基因體學的發達,許多重要生物的基因組序列,如人類、水稻、阿拉伯芥、家蠶及蜜蜂等一一被解碼,為此等生物科技運用開創了嶄新的一頁。家蠶自黃帝時代被人類豢養至今已歷經 3 千多年,為重要的經濟昆蟲,對人類而言,它不僅為經濟生活的重要支柱,也孕育出了源遠流長的絲綢文化。家蠶可大量飼養,絹絲腺為體內最大的蛋白質製造腺體,占熟蠶體重的 40-45% ,因此以家蠶作為蛋白質工廠,產量遠較其它昆蟲為高。家蠶分子牧場主要透過兩大體系:一為藉由基因改造之家蠶桿狀病毒感染家蠶宿主,使家蠶表現嵌入於桿狀病毒中的外源蛋白,由於病毒寄生在宿主體內可大量複製表現,因此外源蛋白產量高,但需克服大量感染及收獲方法等瓶頸;二為直接對家蠶進行基因轉殖,轉殖成功的家蠶具遺傳穩定性,經繼代交配及選育後,可育成具外源蛋白生產能力的基轉家蠶( transgenic silkworm )。日本發展家蠶桿狀病毒表現體系之時間遠早於我國,並早在 1993 年就已進入產業化應用。最著名的是日本東麗公司( Toray Industries, Inc. )利用家蠶核多角體病毒改造而成的桿狀病毒表現載體,成功的生產出治療貓卡希利病毒的干擾素,並獲得日本農林水產省及歐盟藥物管理局的核可上市,成為世界上第一個動物用干擾素產品。在基轉家蠶的發展上, 2008 年日本農業生物資源研究所、東麗公司、東京農業大學、群馬縣蠶業技術中心及紡織研究所,成功的發展出可吐出螢光絲的基轉家蠶,此新聞榮登日本當年度十大農業新聞之首。苗栗區農業改良場保育有 136 種家蠶品系,近幾年來與中央研究院及家畜衛生試驗所合作,利用家蠶桿狀病毒表現體系,發展家蠶分子牧場用以生產豬瘟疫苗,已臻產業化階段,惟以家蠶生產平台產製疫苗屬於創新生產方式,需師法日本產業化經驗;另外,轉基因家蠶之蛋白生產潛力高且穩定,亦為台灣家蠶生技未來值得發展的研究目標。筆者於 2011 年 11 月 14 日至 18 日,前往日本東麗公司及農業生物資源研究所,研習家蠶生物反應器產業化歷程及家蠶基因轉殖技術。茲將研習心得報告如文,供有興趣的學者先進及產業界人士參考分享。

家蠶生物反應器產業化歷程參訪

  東麗公司於 1962 年成立,原生產纖維、紡織、塑料及化學品,現已拓展到資訊通信、醫藥、高性能複合材料等領域,是全球生產 polyester fiber 、 acrylic fiber 及 carbon fiber 等碳纖維之大廠,在日本有 3 個研發中心及 12 個工廠。於醫藥領域生產人類干擾素β -inteferon 及心血管疾病用藥;在農業生技領域建立家蠶生產重組蛋白技術。將貓干擾素( interferon- ω , INF- ω )基因插入昆蟲桿狀病毒( baculovirus )的基因組中,再利用此病毒感染蠶,用以生產 INF- ω 。此產品 1993 年獲得農林水產省核可用於治療貓的 caninparvovirus 及 feline calicivirus 感染, 1994 年以 Intercat® 品牌在日本上市; 2001 年獲得歐盟 EMEA 上市許可, 2005 年獲得歐盟藥物管理局( EMEA )核准用於貓 AIDS 的治療。 Toray 將 Intercat® 委由 Kyoritsu Shoji 公司於日本境內銷售,歐盟部分委由法國公司 Virbac 行銷,以 Vibagen®Omega 品牌銷售此產品,為該地區第一個動物用干擾素產品。 2005 年以家蠶生產犬用 INF- γ 獲得日本農林水產省核准用於犬異位性皮膚炎( atopicder matitis )及犬小病毒( parvovoris )感染,以 Interdog® 品牌在日本銷售。

  日本東麗公司動物用藥部門位於愛媛縣松山市, 以生產動物用干擾素為主 。產品生產流程乃遵循日本藥物生產 GMP 規範,人員進出均受嚴格管制,雙門刷卡,更衣洗手 以防止污染 。工廠內分為材料處理室(家蠶飼育、感染、採血)、離心純化室、層析管柱純化室、品管室及分裝室。無特定病原( specific pathogen free, SPF )家蠶由愛媛縣蠶種株式會社供應,蠶卵於孵化前以福馬林處理,並作好生產環境控制,使用人工飼料餵飼。家蠶於 4 齡後期入 GMP 廠,經過品管室檢測不帶真菌、細菌及病毒後,進入材料處理室進行家蠶桿狀病毒感染,接種及採血等工作。感染以半自動注射法進行,感染後培養於生長箱中, 4 天後以自動採血機收獲 interferon ,溶於 pH2 的鹽酸溶液中,達到不活化家蠶桿狀病毒及目標蛋白粗萃取之雙重目的。含有 interferon 蛋白的家蠶體液以 NaOH 中和到 pH7 ,再以離心方式去除雜質,經層析管柱純化後以冷凍乾燥劑型出售。目前售價 10M U/ 瓶約 4,000 日圓,可供 10 公斤的貓狗一次治療劑量,以整個療程需處理 3 次計,約需 12,000 日圓(約新台幣 4,800 元)。在家蠶品種上,現有品種每隻可採集到 1 毫升的體液量,每隻家蠶售價約台幣 40 元。整個生產流程中以層析管柱最為耗時,約需 2 週的時間;冷凍乾燥流程因成本高,採委外進行。東麗公司以家蠶生產動物用藥的模式,可作為臺灣未來以家蠶生產動物用疫苗之重要參考。

日本家蠶基因轉殖研究概況

  日本農業生物資源研究所( National Institute of Agrobiological Science )下設有基轉生物研究中心,轄下之家蠶基因轉殖組( Transgenic Silkworm Research Unit ),以從事家蠶基因轉殖之研究與應用為主要方向。由於家蠶絲腺可生產高量絲蛋白,為良好之蛋白生產載體。該所 Tamura 及 Kanda 兩位科學家,於 1990 年利用果蠅的轉座子( transposon ) piggyback 載體,配合酵母菌的 Gal4/UAS 雙效表達體系,以蠶卵微注射技術,發表了第一個基轉家蠶,發展至今,此體系已應用於螢光絲、蜘蛛蠶絲及醫用纖維的研究上,也成為許多未知功能基因研究之主要工具。為克服蠶卵殼太厚,微注射轉殖不易的問題,該中心發展出電動操作,配合玻璃毛細管注射之技術,增加注射速度、提高蠶卵孵化率及基轉家蠶成功率。除了日本農業資源研究所外,信州大學、東京農業大學及九州大學等,均投入相當的人力在家蠶轉基因產品之開發,已發表絲素啟動子驅動螢光基因,使得蠶吐出螢光絲;選育高絲量的品種,含絲量可達每隻蠶 75 毫克;轉殖 acidic peptide 基因到家蠶中生產較細、品質較佳的蠶絲供產業應用;轉殖 poly-glutamic acid 基因以產生對鈣親合性較高的絲纖維,應用於骨折後之治療可使傷口提早癒合等成果,以基轉家蠶生產「機能性絲製品」為目的之研究,為日本基轉家蠶之主要標的。

  家蠶基因轉殖的研究,配合家蠶基因組全長定序工作的完成,應用已更為廣泛。依據 2004 年發表之家蠶基因組草圖,家蠶共有 28 對染色體, 490M b , 18,510 個基因,累積至今之資訊,可在 KAIKObase 資料庫中( http://sgp.dna.affrc.go.jp/index.html )找到,未來家蠶中重要基因之分離、分析及應用,將隨著基因組解碼而更加蓬勃。

蠶卵微注射技術研習

  本次赴日在田村俊樹博士之安排下進入日本農業資源研究所「昆蟲遺傳子組換設施」,進行蠶卵微注射研習。用來進行卵微注射的家蠶品種為非滯育型( non-diapause )蠶卵,無休眠性,轉殖率高( 28-54% )。蠶卵產下後 4-8 小時,挑選卵大形狀端正之蠶卵,以福馬林薰蒸消毒及蒸餾水清洗後,以毛筆將卵排列於載玻片上。將載玻片置於顯微鏡置物台上,利用機械手臂先以鎢絲針在卵殼上戳洞,再利用玻璃針將 DNA 注入卵中,最後以瞬間接著劑封住傷口,即可置入生長箱培養孵化。

  蠶卵微注射為技術性甚高之工作,操作技巧決定轉殖率的高低及家蠶存活率,田村博士解釋因蠶卵卵殼比較厚,當初為發展家蠶微注射轉殖技術,開發了機械手臂配合,現已有半自動模式,大大提高了注射效率及成功率。轉殖載體經多次試驗,最後選定 piggyBac vector ,搭配 UAS/GAL4 system 來作轉殖。整個昆蟲遺傳子重組設施為獨立建築,進出需刷卡管制,雖無負壓或 air shower 等設備,洗手換拖鞋、內外進出門共二道;家蠶飼育採人工飼料、於庫板隔成的房間內進行,有別於一般開放之實驗室,顯然日本方面對遺傳子操作的態度相當嚴謹。

心得及建議

  日本之家蠶基因轉殖技術執亞洲地區之翹楚,產業化應用市場,如 Toray 、 Unitech 、 Neosilk 、片倉工業等亦相當蓬勃。以東麗公司為例,在人員管控及材料區隔上均有其標準作業,看似簡單的過程,實際上為產品成功與否的重要環節。本場這幾年與中研院及家衛所合作進行「以家蠶為生物反應器生產豬瘟疫苗」計畫,與東麗公司干擾素生產平台類似,只是目標蛋白的不同。筆者以為該公司成功產業化的關鍵,為穩定的 SPF 家蠶供應鏈及正確之目標蛋白選擇,動物用干擾素純化容易、賣價高、於家蠶內表現量高。未來台灣如果要發展以家蠶生技, SPF 家蠶的生產技術應為最重要之關鍵,也是苗栗場未來的研發重點。台灣的家蠶生物反應器團隊,為了讓家蠶平台能走向產業化,歷經了多年的努力,好不容易克服諸多技術瓶頸,作出 E2 生產之雛形,未來如何製定各環節的標準作業流程,以取得許可證,並開發出清淨、符合 GMP 規範之家蠶材料、降低生產成本,將是產業化成功與否之重要關鍵。

  日本保育之 400 餘種家蠶種原為家蠶生技發展之重要基礎,鑑於家蠶現已成為研究昆蟲之模式物種,不僅基因組全長定序完成,也在遺傳、生理、生化、昆蟲病理上受到廣泛的應用,所有的種原特性已非常清楚,可在 National Biosource Project 下的 ”Silkworm Genetic Resource Database” ( http://www.shigen.nig.ac.jp/silkwormbase/index.jsp )找到,並提供材料分享,供學術研究使用,使用者只需填寫材料移轉同意書( material transfer agreement, MTA )即可取得。

  台灣之家蠶種原過去根據「蠶種法」,除推廣種外不得外流,外界取得原種的困難,侷限了研究空間及應用。而苗栗場每年耗費相當大人力、物力在家蠶之繼代保育上,若能仿照日本模式在完成種原庫性狀調查或選育後,命名並釋出分享,讓家蠶種原得以發揮學術上的功能,家蠶研究及產業應用在國內必更加蓬勃。 有鑑於此,本場已於 101 年 2 月 21 日制定「行政院農業委員會苗栗區農業改良場蠶蜂新品種登記命名要點」,未來將透過新品種命名推廣,將具有價值的新品種釋出分享,促進家蠶學術及產業之發展。

東麗公司愛媛縣工廠

東麗公司愛媛縣工廠

以人工飼料餵飼基轉家蠶

以人工飼料餵飼基轉家蠶

挑選蠶卵作微注射轉殖

挑選蠶卵作微注射轉殖

日本家蠶種原資料庫,種原特性完整記載

日本家蠶種原資料庫,種原特性完整記載

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