水產試驗所 張錦宜 ． 吳嘉哲 ． 陳力豪 ． 林金榮

一 . 前言

　　乳酸鏈球菌（Lactococcus garvieae ）是一種兼性厭氧、不具運動性亦不會形成孢子的革蘭氏陽性球菌。早期臺灣養殖魚、蝦類常見的水產鏈球菌感染症，學者一般都認為係因Streptococcus spp. 感染所致；但自 1988 年L. garvieae 由Streptococcus 屬獨立成一屬後，愈來愈多的本土研究發現，臺灣養殖虹鱒、泰國蝦、烏魚、金目鱸及吳郭魚的水產鏈球菌感染症，其致病的禍首有相當大的比例（約四分之一）其實是乳酸鏈球菌。而日本的紅魽鯵、歐洲、澳洲及南非的虹鱒和地中海周邊地區的鯛科魚類養殖業者，更是早將水產病原性乳酸鏈球菌視為頭號大敵。水產動物遭病原性乳酸鏈球菌感染後會導致嚴重的溶血性敗血症，病魚出現凸眼、角膜白濁或充血，腹部皮下出血，肛門周圍潮紅（圖 1 ）等病徵；病蝦則會有肌肉組織白化及肝胰腺腫大等病變，罹病後死亡率高，往往造成養殖業者極大的損失。而且L. garvieae 成長緩慢，以傳統微生物方法分離培養不易，常常因為其他細菌的汙染，導致誤診或延誤疫情防治。有鑑於此，水產試驗所開發出一個可以完全由一般養殖業者操作、自行檢測各種樣本中常見水產乳酸鏈球菌的簡易套組（Lactococcus garvieae detecting kit, 以下簡稱 LG-kit ），以降低養殖現場發生大規模疫病蔓延的風險，避免不當藥物的錯用、濫用，提高臺灣水產養殖的國際競爭力。

二 . 細菌實體資料庫及工作母片的建立

　　本研究採用 27 株水產病原菌、 30 株淡水環境常在菌、 30 株海水環境常在菌及 8 株衛生指標菌 ，計有 17 屬、 54 種、 95 株不同細菌做為 細菌實體資料庫， 其中包含 15 株得自 8 個不同來源的L. garvieae 作為本套組設定的目標菌株。將此 95 株菌製作成可供多次複製分析的工作母片（ multiple inoculation master plate ），俾快速分析各菌株之特異性狀，篩選適合做為試劑開發之呈色反應。

三 . LG-kit 之研發

　　利用上述工作母片，逐一進行各菌株之形態、色素、運動模式、氧氣需求、代謝途徑、適溫、適鹽、血清學等特性分析及 16S rRNA 、 16S-23S rRNA 序列之比對，並利用 BIOLOG ^TM 、 API ^TM 、 MICROBACT ^TM 等生化試驗套組分析 27 項生理、生化性狀， 95 項碳源利用及 19 項酵素活性，以篩選出僅目標菌株有作用且具呈色反應之特異性性狀，並汰除容易因不同檢體背景（淡水、海水、高鹽、高糖、富含動物組織及 pH 變化等）而導致呈色反應不穩定的項目，再以 95 株臺灣水產常見病原菌與養殖環境分離菌株為試驗檢體，交叉測試反應結果。最後開發出的檢測套組原型為體積約 125 μl 之液狀試劑，檢測時僅需滴加 40 μl 之檢體，於 28 ℃ 反應 24-48 小時即可以肉眼判讀，若試劑從無色變為紅紫色，則表示檢出水產乳酸鏈球菌L. garvieae 。

本套組原型開發完成後，即進行專一性、靈敏度及藥物敏感性測試。

四 . 準確性與專一性測試

　　以 0.85% NaCl 溶液將上述 95 株臺灣水產常在菌標準菌株及養殖環境分離菌株逐一製成濁度為 Mcfarland No.5 的細菌懸浮液，分別添加 40 μl 入 LG-kit 中，於 28 ℃ 持續培養觀察 48 小時， 以檢測 LG-kit 的準確性與專一性。結果其中 15 株L. garvieae 均會變色，準確性達 100% 。專一性方面，在 80 株非屬L. garvieae 的供試菌株中，有Enterococcus faecalis 、 Vibrio vulnificus 及 Pseudomonas pleoglossicida 等 3 株也出現類似的呈色反應 ，總計專一性達 96% 。

五 . 靈敏度與定量檢測

　　將 8 株分離自不同檢體的 L. garvieae 製備成 10 倍連續稀釋懸浮液，先以傳統平板計數法計算細菌數目 ，再依本套組標準檢測程序進行檢測與判讀，每 12 小時判讀一次，以測試本套組定量分析的能力及所能偵測的最小病原菌濃度。結果顯示，若 LG-kit 於 24 小時之內變色，表示檢體中L. garvieae 的數量 >10 ⁷ CFU/ml ，在養殖現場的健康管理上，屬於隨時會爆發疫情的高危險等級；若 LG-kit 在 24-48 小時期間內變色，表示檢體中L. garvieae 的數量介於 10 ⁷-10 ⁵ CFU/ml ，對應於養殖現場，係屬應立即改善管理措施，否則很可能會陸續出現病魚的警報等級；若超過 72 小時後 LG-kit 才變色，表示檢體中L. garvieae 的數量少於 10 ³ C FU/ml ，為安全衛生的正常情況。

　　此外，與標準微生物學方法比較，本套組對不同 L. garvieae 菌株 的檢測靈敏度可達 10-10 ³ CFU/m l （圖 2 ）。其中對 分離自養殖泰國蝦及吳郭魚的本土菌株靈敏度較高， 在 10 C FU/ml 細菌濃度等級即可被檢出；對 國外購入的參考菌株靈敏度較低， 在 10 ³ C FU/ml 細菌濃度等級才可被檢出 。

六 . 藥物敏感性測試與抗藥性菌株篩選

　　將不同濃度的抗生素藥物預置於 LG-kit 中即可製成 LG-kit 藥物敏感性檢測套組（ LG plus susceptibility assay kit ）。其操作方法與 LG-kit 相同，只需添加 40 μl 檢體懸浮液於套組內 ， 24 小時內出現紫紅色呈色反應者，為無效藥物（圖 3 ）。以 LG-kit 藥物敏感性檢測套組所得的 試驗結果亦與 NCCL 標準方法結果相符。此外，將分離自不同來源的L. garvieae 以 LG-kit 藥物敏感性測試套組檢測，即能快速篩選出不同的抗藥性菌株。

　　以藥物防治病原菌為養殖健康管理措施中最後才應考慮使用的手段。 LG plus susceptibility assay kit 之開發，主要目的在縮短傳統藥物敏感性試驗所需的時間，每一種藥物之用法、用量及停藥期，仍應依法諮請合格獸醫師開立處方箋，據以購買經農委會「水產動物用藥品使用規範」公告合法之水產動物用藥。另藥物的使用時機亦需配合 LG-kit 的檢測結果，當 LG-kit 超過 48 小時才變色，顯示水中病原菌數量仍屬安全或低危險指數時，建議優先使用換水、改善底質環境、調整投飼量及檢討生鮮餌料衛生等對策，疫情緊急時才考慮使用藥物。

七 . 結論

　　LG-kit 可準確地檢測出水產乳酸鏈球菌L. garvieae ，並可推估出檢體中L. garvieae 的平均數量，快速篩選出抗藥性菌株；又因為不需使用到繁雜的技巧或特殊的儀器設備，故適合實際應用於養殖現場之健康管理。若能對每一養殖池均建立長期連續的監測記錄，如此，當水中病原菌數量異常增加時，即可在第一時間做最適當的處理。善用此一簡易、快速的病原菌檢測工具，當可真正落實「預防勝於治療」的健康管理原則。

　　發展快速、靈敏、省力的檢驗試劑為全世界疾病防治的重要研究方向，農委會水產試驗所近年來亦致力發展快速、靈敏、省力的水產病原檢驗方法，所開發的「一點靈」簡單試劑，為一系列能由養殖業者自行檢驗病原，不需假手技術人員，不需使用額外的儀器，簡易、快速、便宜的養殖健康管理工具，已陸續開發完成的品項包括：「鰻魚潰瘍症病原菌快速檢測套組」、「溶藻弧菌檢測套組」、「水質總生菌數檢測套組」、「親水性產氣單胞菌檢測套組」、「水產病原性弧菌檢測套組」及「水產乳酸鏈球菌檢測套組」，現正積極尋求有意願技術移轉的廠商，希望藉由商品化的推廣，能有助於降低養殖現場發生大規模疫病蔓延的風險，避免不當藥物的錯用、濫用，提高臺灣水產養殖的國際競爭力。

圖 1 乳酸鏈球菌感染之金目鱸外觀出現眼紅腫凸起，腹部皮下出血，肛門周圍潮紅等明顯病徵

圖 2 LG-kit 靈敏度試驗。以 10 倍連續稀釋不同來源的 L. garvieae 懸浮液 進行 LG-kit 檢測，結果顯示樣本中 乳酸鏈球菌濃度達 約 10-10 ³ CFU/ml 即可產生呈色反應

圖 3 以 LG-kit 藥物敏感性試驗套組篩選出抗藥性不同的 乳酸鏈球 菌。 FFC ：氟甲磺氯黴素 、 OA ：歐索林酸、 OTC ：羥四環黴素、 S3 ：磺胺一甲氧嘧啶、 UB ：氟滅菌