文 / 農業試驗所　王昭月‧吳明哲

壹、前言

　　國際間對於商業生產作為經濟栽培用的種子品質規範，通常參考「國際種子檢查協會」（ International Seed Testing Association, ISTA）訂定的種子發芽活力檢定與純度鑑定等標準流程。但對於高單價的一代雜交種子（F₁ 種子），除必備的高生長勢、成熟期一致、豐產、病蟲害抗性等諸多優良特性外，對於其品種純度要求更為嚴峻，檢測技術則需符合快速、精確的目標，以爭取最佳出貨時效。傳統利用生長特性（grow-out traits, GOTs）的檢定方式，僅調查外觀性狀差異，所需檢測時程較長且需要較大的栽培人力及空間，又因季節環境限制，容易造成檢測困難或性狀難以判別的不確定性。近 30 年間，分子生物分析技術進步神速，已建立多種分子標誌包括蛋白質分子與核酸層次的 DNA 分子標誌 （molecular markers），農業上已實際應用此分子標誌作為品種鑑定及性狀遺傳分析，或進行標誌輔助選種 （marker-assisted selection, MAS） 等。由於分子標誌兼具早期快速檢測及高正確性等優點，又不受限於季節氣候差異之影響，因此已成為現代作物遺傳純度檢定的有效工具。

貳、DNA 分子標誌應用於臺灣外銷蔬菜雜交種純度之檢測

　　臺灣外銷蔬菜一代雜交種子之生產種類以葫蘆科作物－西瓜與甜瓜、茄科作物－番茄與番椒及十字花科蔬菜－花椰菜等為較大宗。傳統業者仍採用 GOTs 方式進行品種純度之檢定，依作物種類差異約需 1 至 3 個月不等之時程。而利用聚合酵素連鎖反應（polymerase chain reaction, 簡稱 PCR） 為基礎的 DNA 分子標誌分析，可於 1 週內取得純度檢測結果。以 DNA 標誌進行指紋分析兼具以下優點：(1) 以核酸為基礎，在各個組織、各個發育時期均可檢測，不受季節、環境限制；(2) 分子標誌種類很多，可同時使用多種標誌進行鑑定與重複比對；(3) 依作物建立的高度多型性的分子標誌，可延伸作為種間或種內品種鑑定之應用；(4) 透過共顯性分子標誌（co-dominance marker ），可鑑別出同質基因型或異質基因型，特別適合雜交種與親本間之鑑別。倘能結合種子品質管控必備的工作流程-種子活力檢測，利用已完成發芽勢（含發芽率）檢定的發芽苗（約 5-20 mg），接續進行雜種純度之 PCR 分子標誌分析，可進一步獲得品種純度之資訊。

　　有鑑於大量 F₁ 種子樣品以及採用微量發芽苗的 PCR 分析方式，農業試驗所於 2010 至 2012 年期間，針對臺灣重要的外銷採種作物－西瓜與花椰菜，分別開發完成「西瓜 F₁ 種子微衛星標誌純度鑑定技術」及「花椰菜品種雜交一代種子純度 CAPS 快速檢測技術」兩項分子標誌，可用以檢測雜交種之純度。分子標誌利用於 F₁ 種子純度檢測的開發過程中，亦經由 3~10 批次以上的田間檢查對照，確認其 DNA 分子標誌分析結果與外表型的檢定結果呈現一致。目前將此分析技術已分別技術移轉至國內 3 家外銷採種業界，實際運用於出口種子之品質管制工作。

以下分別簡介「切割擴增多型性序列標誌」及「簡單序列重複標誌」兩種分子標誌，以及如何運用於商業花椰菜 F₁ 雜交種及西瓜 F₁ 雜交種純度之檢測。

一、切割擴增多型性序列（簡稱 CAPS）標誌應用於花椰菜商業 F₁ 雜交種之檢測

　　花椰菜為冷涼型氣候的蔬菜，在臺灣特別適合 10 月至翌年 4 月期間生產栽培。花椰菜也是國際間重要的蔬菜作物，是十字花科三大蔬菜之一，全年在不同地區、不同季節均有經濟栽培。有鑑於全球性周年生產的廣大需求性，近年臺灣的種苗業界積極新育成多樣化的優良品種，其中包含 不同生育日數的早、中、晚生品種，以及具有耐逆境特性（耐熱、耐寒、耐濕）等高適應性品種，並成功開拓印度和中國大陸等大面積生產區的外銷市場。年產值估計約達新台幣 5 億元，成為臺灣外銷蔬菜一代雜交種子的主力之一。出口的花椰菜種子是 F₁ 品種，生產過程難免混雜自交種子等，因此純度檢測工作甚為重要。種子純度愈高者，隨之售價也愈高；如雜交種子純度達 95%~98% 以上，相較於一般 90% 者約可提高 1.5~3 倍的售價。

　　切割擴增多型性序列（cleaved amplified polymorphic sequences, 簡稱 CAPS）標誌，是一種以單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism, 簡稱 SNP）為基礎的分子標誌。SNP 緣於基因組 DNA 序列中發生單核苷酸（A,T,C,G） 的替換、插入或缺失，而呈現出多型性的差異。在基因編碼區（coding region） 發生“ 非同義 ”（non-synonymous）的單核苷酸變異 ，將影響轉譯的氨基酸序列，進而產生蛋白質序列及蛋白質功能之改變，故此分子標誌也適合於特定性狀的遺傳鑑定之使用。由於 SNP 在生物基因組的分布廣泛，依生物種類差異，平均發生頻度約為每 50~300 鹼基對 （bp） 出現一個 SNP，故可提供的標誌數量巨大，因此被譽為新一代分子標誌 。而 應用次世代定序（next generation sequencing） 的 SNP 分析方式，需要搭配較昂貴儀器與生物資訊處理技術，才能真正發揮效用。近代學者 則 應用 SNP 基礎，開發出共顯性分子標誌－切割擴增多型性序列（CAPS） 分析技術，CAPS 是特定引子的 PCR 產物再 結合限制性內切酶的分析技術，可反應出特定 SNP 的多型性。而 CAPS 標誌操作設備簡單，分析結果的再現性穩定，容易判讀又適用於特定性狀的篩檢或品種鑑定等目標。作物種苗生產上也進一步利用 EST-CAPS 標誌進行特定樣品的雜種純度分析 如青花菜 F₁ 種子純度檢定之利用。伴隨現代生技產業的快速發展，完成基因組解序的作物與日俱增，透過特定性狀相關的序列資料庫之搜尋，可設計與利用的 CAPS 標誌更為豐富，更方便於不同物種鑑定之利用。

　　農業試驗所針對臺灣外銷花椰菜雜交種的採種業界在純度檢測上的需求，搜尋美國 NCBI（National Center for Biotechnology Information）十字花科表現序列標幟（expressed sequence tags, 簡稱為 ESTs）之核酸資料庫，開發高通用性的 CAPS 標誌，另配合建立花椰菜單粒種子（3mg）或播種 3~4 天的幼苗（20mg）微量 DNA 萃取技術，可在 1 週內快速完成雜交種之檢測 （圖 1 、圖 2） 。本項 CAPS 分子標誌來自高度保守區域的單一核苷酸多型性差異，兼具精確與通用性高。經測試所研發的共通性引子組 3 組，可適用於 15 個以上雜交品種的種子純度檢定。本技術已轉移國內 2 家蔬菜採種業者，提供其花椰菜品種之 F₁ 種子純度檢測應用，具有提高檢定精確性暨縮短分析時程的雙重效益，可因應業界自主性的品管之需，提升蔬菜採種產值與國際競爭力。

圖 1 　 花椰菜雜交種之分子檢測 ：以播種 4 天的發芽苗為材料，於 1 週內可完成檢測，取得雜交種的分子檢定圖譜。

圖 2 　 花椰菜雜交種子播種後的傳統性狀調查 ：傳統田間性狀調查方式約需 8 週栽培期，利用外觀差異以分辨出雜交種或混雜株。

二、簡單序列重複（簡稱 SSR ）標誌應用於商業上西瓜一代雜交種之檢測

　　西瓜適合溫暖氣候生長，依據 2013 年農業生產年報統計，近 3 年台灣西瓜栽培總面積均穩定維持於 11,000 公頃左右，位居國內第一位的瓜類作物。早年（1956 年）在「 農復會 」（「行政院農業委員會」最前身機構）支助下，農業試驗所鳳山熱帶園藝試驗分所，開始進行有系統的品種改良工作，育成大西瓜‘ 富光 ’、無子西瓜‘ 鳳山一號 ’等優良品種。至 1968 年農友種苗公司成立，採種的種苗中更以西瓜品種最為著名，迄今約 45 年間已育成 60 餘種馳名中外的西瓜品種，包含國內常見的紅肉小西瓜（如：‘ 黑美人 ’、‘ 秀鈴 ’等），黃肉中小型西瓜（如：‘ 金蘭 ’、‘ 特小鳳 ’等），而‘ 金蘭 ’與‘ 寶冠 ’兩品種都曾獲得美國園藝品種比賽優勝獎。而農業試驗所又於 2003 年與 2004 年，相繼推出兩個西瓜新品種：‘ 台農六號 - 紅蜜 ’、‘ 台農七號 - 小甜甜 ’。綜觀台灣的西瓜育種技術和推出的優良新品種，仍稱冠於國際，也名列 國內外銷 F₁ 種子的第一大經濟作物。

　　簡單序列重複標誌（simple sequence repeat, 簡稱 SSR marker）歸類於微衛星標誌（microsatellite markers）。關於微衛星 DNA 研究，可追溯至 Tautz 等人（ 1984）發現真核生物的基因組上存在 1 ～ 6個核苷酸的短序列重覆（short tandem repeat），這種序列在不同 「物種」 間表現高度多型性。近代學者 Condit 與 Hubbell （1991）在植物的基因組，也發現這種 SSR 的存在，Lagercrantz 等人（1993）並通稱這些短序列重複，為微衛星 DNA（microsatellite DNA）。早期的微衛星分子標誌分析，多透過個別的作物核酸序列資料庫，搜尋其中出現頻度較高的 SSR 序列，涵蓋其兩端鄰近的序列，合成 PCR 分析專一性引子對，針對同種間或種內生物進行核酸層次的遺傳分析。農業試驗所鑑於外銷採種西瓜 F₁ 種子純度檢測的需求，開發國際認同的 SSR 分子標誌，以輔助品種純度之檢定。目前建立核心 SSR 標誌 20 組以上，可作為種子純度檢測之利用。另為簡化種苗取樣技術，免去 DNA 萃取手續，以發芽幼苗（7 天）的微量子葉（20mg），直接進行 SSR-PCR 分析，可提升鑑定效率（圖 3 、圖 4）。「西瓜 F₁ 種子微衛星標誌純度鑑定技術」於 2010 年技術轉移國內 1 家採種業者，可提供其 F₁ 種子純度檢測應用。目前透過其共顯性分子標誌的特質，種苗業者更進一步利用此分子標誌，進行採種親本遺傳同質性（純度）的監測，以確保 F₁ 雜交種子採種的一致性與穩定性。

圖 3 　 西瓜雜交種子之分子檢測 ：播種約 6 天的發芽苗，切取 1~20mg 子葉，即可進行 SSR-PCR 分析 。

圖 4 　 西瓜雜交種之分子檢測圖譜 ：以簡單序列重複標誌（左圖為 WM224 ；右圖為 WM330 ），進行於西瓜雜交品種之鑑定 ，並取得雜交種的分子標誌檢定圖譜。

參、結語

　　種苗公司生產雜交種需要進行種子品管工作，確保雜交種子活力，同時管控雜交 F₁ 種子純度，降低母本發生自交種子的汙染發生，滿足商業生產必要的規範與純度要求。GOTs 是 ISTA等國際種苗組織與業界傳統使用的純度檢查方法，此方式需要建立正確且具有代表性的標準樣品 （雜交種）之多個特定性狀資料，以挑選其中數個穩定的園藝性狀，再依據待檢定作物的異交特性或批次數量，分別取樣 100 個或更多的雜交種材料，進行田間栽培之對照比較，並依據外觀性狀說明異品種（off-type）或自交（sib）種子發生的比率，取得該批次種子之純度。鑑於 GOT 方法費時，空間需求大，容易因環境影響而導致不明確鑑定之誤差。利用多種 DNA 分子標誌進行商業雜交種子純度 鑑定，其檢測效率與正確性可與國際規範接軌，平均花費時間約僅需 1 週，相較傳統 1 至 3 個月的 GOT 方式更節省人、物力成本。配合微量 DNA 樣品，進行高通量、高效率的分子標誌 PCR 分析，已成為現代化商業種苗生產上實務應用的有利工具。