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體細胞複製牛「如意」育成報導

畜產試驗所 沈朋志‧李善男‧曲鳳翔
台灣大學畜產學系 鄭登貴

 

一、 前言

  發展家畜複製科技之目的,除期能藉此技術大量複製遺傳背景一致且性狀表現優良之畜群,進而提高家畜之經營效率外,亦希望能應用此技術產製基因轉殖家畜,以協助將傳統畜牧事業轉型成生物科技產業。雖然目前各種產製基因轉殖動物方法中,仍以原核基因顯微注射法最被廣泛使用,惟最近已證實利用複製技術之基因轉殖動物產製效率(60~100%)遠超過原核注射法者(4.4%),無疑體細胞複製技術已被公認係最具效率及發展潛力者。本會畜產試驗所及國立台灣大學畜產學系組成之研究團隊先後以體細胞核轉置技術產製出複製羊「寶吉」、「寶祥」與複製牛「如意」,這些成果除證明國內體細胞複製家畜之技術發展已漸成熟,更顯現國內利用此技術建立更具效率之基因轉殖技術平台已概然成型。過去本研究團隊雖曾利用卵丘細胞為供核源成功分娩複製牛「畜寶」,然鑒於卵丘細胞之體外分裂能力遠不如耳朵細胞者之事實,因此,為達成利用複製技術產製基因轉殖家畜之目標,於執行複製牛「如意」之產製計畫前即決議選用具較佳體外分裂能力之成體耳朵細胞為供核源,除期藉以成功育成體細胞複製牛外,並擬將產製過程所建立之各項技術,作為以後進行基因轉殖牛產製試驗之參考。

二、 複製牛之產製方法

  (一)受核卵母細胞之取得

  自屠宰場取得之荷蘭牛或台灣黃牛卵巢,先吸取其表面直徑2~5 mm 之未成熟濾泡內之卵丘-卵母細胞複合體(cumulus-oocyte complexes, COCs),再將卵丘細胞包被完整之卵丘-卵母細胞複合體,予以體外成熟培養18~19小時,並選取具排出第一極體者,供為受核細胞去核操作之用。

  (二)供核細胞之建立

  將荷蘭母牛之耳朵經消毒後剪取其組織,取得之耳朵組織先予細切及以胰蛋白酶(trypsin)處理,以分離耳朵纖維母細胞。取得之耳朵纖維母細胞經初代培養後,冷凍備用。

  (三)核轉置顯微操作

 

  1. 供核源細胞週期期別之調控

      將冷凍於液態氮之牛耳朵纖維母細胞先予解凍後培養1天,再利用血清饑餓法(血清濃度自10%降至0.5%)調控其細胞週期靜休於G0期,備供核轉置使用。

     

  2. 核轉置胚之產製

     

      將細胞週期期別調控於G0期之單一牛耳朵纖維母細胞,分別注入已去核之受核卵母細胞之卵膜間隙內,並隨即施以電融合處理。已融合之核轉置胚於恆溫培養箱培養4小時後再予激活處理,以獲得核轉置牛胚。

 

  (四) 核轉置胚之體外培養與胚移置

  利用牛耳朵纖維母細胞為供核源所產製之核轉置牛胚,於激活處理後即置入含單層卵丘細胞之培養液滴中(38.5 ℃, 2% CO2, 100% 相對濕度)進行共培養(co-culture)。開始培養 48小時後,首次鏡檢核轉置胚之卵裂率。其後,連續8日每隔24小時觀察記錄核轉置胚之發育胚期。待核轉置牛胚於體外發育至桑椹期或囊胚期時,即直接移置入性週期同步化之受胚牛子宮內。

三、 結語

  本試驗利用牛耳朵細胞為供核源產製複製牛胚過程中,卵母細胞之去核成功率為89.2%(1170/1311)、核轉置胚之融合率為87.5%(938/1064)、另741個核轉置胚經體外培養後有670個具卵裂者(90.4%),其後續發育至16-細胞期者有384個(58.5%)、桑椹胚期者有337個(45.5%)及囊胚期者有278個(37.5%),此成果顯示各項技術已達國際水準。其後,將品質良好之囊胚移置入受胚牛子宮,並在歷經完整之懷孕過程後,分娩獲致一頭健康之複製犢牛,其出生體重為42.5kg,且經DNA親子技術鑑定後,證實其遺傳背景確與原供核細胞相一致,而證明其確為複製牛。複製牛經後續之觀察照料,期間所進行之各項生理測定值均與正常牛者相似,顯示複製牛「如意」已成功被育成,目前已超過6月齡,體重約達150公斤,此乃我國成功產製複製牛之首例。

  複製牛「如意」之成功育成,顯示我國複製科技已達國際水準;動物複製技術平台之建立,亦表示進行後續相關之基礎與應用研究之可行性;未來除可應用於複製優良或具有特定性能動物外,也可以為產製基因轉殖動物與建立分子牧場提供重要的技術平台,更是復育瀕臨絕種動物一個有力的手段。同時,以核轉置配合胚幹細胞科技與組織工程之研究,對於開發與建立從人類體細胞產製可供自體移植所需之細胞、組織或器官的再生醫療動物模式之應用的潛能更是無可限量。

 

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