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動植物病原診斷鑑定新技術─xMAP

動植物防疫檢疫局 張世忠
興大生科所 胡仲祺

前言

  對於人類重要疾病病原或動植物有害生物的首次鑑定確診,通常需依循柯霍氏法則(Koch,s postulates)進行,依此法則需滿足4項條件:(一)在病患或罹病之動植物上能找到相同的病原;(二)由罹病體分離出來的病原應能純化或培養;(三)純化或培養出來之病原接種到實驗動物體或相同之動植物時,仍會引起相同之疾病或病徵;(四)發病後仍可自接種之實驗動物體或動植物中分離出相同病原。但如每次確定病因都經此法則歷程的話,則所需耗費的時間相當長,有部分種類甚至還需經各種不同測試始能斷定。隨科技的發展日新月異,許多疾病在確定病原後,後續之診斷鑑定技術不再繁瑣,所花費之時間亦大幅之縮減,尤其在血清學研究方面有關酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,簡稱ELISA)之技術平台建立後,疾病或病原之診斷有了突破性之發展。藉由各種病原或有害生物之多元抗體、單元抗體、抗原、抗血清的純化,診斷的歷程可在數小時至數天內確認結果。而分子生物技術的發達,專一性核酸探針之建立,也使得診斷鑑定靈敏度更大幅提昇;聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,簡稱PCR)技術平台的蓬勃發展,診斷方法也更加多元化,在診斷準確性、速率及效率上均往前邁進一大步。

診斷鑑定技術的要求與發展

  針對單一種病原或動植物有害生物診斷鑑定技術的要求,是期望能夠達到(一)準確、(二)快速、(三)簡便等三要項。這三要項中首重的是準確,不準確的鑑定結果,即使再簡便、再快速也是枉然。在準確的前提下,其次是能夠快速的診斷鑑定出結果,此對於阻擋重要疫病原的入侵、蔓延,將可扮演及時關鍵之角色。在準確與時效上均能符合要求時,簡便的操作方式則是另一項重要考量,當技術、設備或實驗室的門檻過高時,則可執行的單位、研究人員便較少,所能發揮共同防杜疫病原入侵之偵測點相對也較少,加上送樣至特定實驗室需花費許多時間,送樣過程也會增加受污染之機率,因此簡便的操作技術與過程,將是診斷鑑定技術能否普及之關鍵因子。目前PCR、ELISA等技術已初步可達成上述三要項之要求,不過在時效上及簡便性方面仍諸多改善空間。而應用單一步驟免疫層析法(one-step immunochromatography)所開發之產品如市面上常見驗孕棒等,其在時效性及簡便性上已有相當大之突破,惟在靈敏度上仍需加強。而國人自行研發之植物病毒診斷試劑套組則已具單一步驟免疫層析法般快速、簡便之優點,且其靈敏準確度與實驗試所採行ELISA檢測法相當,甚至更靈敏,此診斷試劑套組為符合目前針對單一或少數幾種有害生物診斷鑑定所要求準確、快速、簡便三要項之技術與產品。

圖1 國人自行研發之植物病毒診斷試劑套組目前已符合準確、快速、簡便三要項

圖1 國人自行研發之植物病毒診斷試劑套組目前已符合準確、快速、簡便三要項

  而當大部分研究室數十年來的深入研究已累積大量重要疾病病原或有害生物專一性探針、抗體、抗原、抗血清時,大多數人便期待針對同一樣本能夠同時檢測數十種,甚至百種、千種之重要疾病或有害生物,進而大幅縮短不同疾病的診斷時程,這個期待因而驅使並孕育了生物晶片的誕生。DNA晶片的出現,讓世人眼睛為之一亮,也因而造就許多生技產業的蓬勃發展,但DNA晶片經過這幾年來的發展,卻也逐漸遭遇到一些亟待克服的瓶頸,包括微陣列點陣儀器價格昂貴(從早期的數千萬,到現今便宜者仍需數百萬不等);晶片製作完成後價格仍高昂;販售時也牽涉到相關專利問題;測試結果仍需倚靠判讀機器來進行等問題;另外,理論上每片DNA晶片雖可點陣一萬點以上之測試點,但就現實應用上似無如此大之需求量,加上同時點陣上千點以上之探針時,所需耗費之成本相當高,但對檢測之樣本能發揮實際功能之檢測點可能不及百分之五。因此,能夠同時檢測數十種目標點之技術或方法,就目前市場需求面來說應屬足夠與恰當。

xMAP檢測技術的原理

  為滿足大多數研究人員同時檢測多種病原或目標物之需求,並克服DNA晶片所遭遇的瓶頸,國外在3年多前已成功研發完成一種新的檢測技術平台,並持續推廣應用中。此種檢測技術簡稱為xMAP,英文全名為flexible Multi-Analyte Profiling,由於檢測反應均在液態中完成,也稱為液相晶片(liquichip)。xMAP的檢測法原理敘述如下:

(一)利用聚苯乙烯(polystyrene)所製作的微珠,包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑,而產生100種不同比例顏色之微珠,每顆微珠之大小約5.6微米(microns),這些微珠可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酵素分析、受體和配體識別分析等,而標定上特定抗體、核酸探針與各種受體探針,為了區分不同的探針,每一種用於標記探針的微珠都帶有一個獨特的色彩編號。

圖2 利用聚苯乙烯所製作完成大小約5.6微米,透過不同比例的紅光與紅外光發色劑所構成100種不同顏色之微珠 圖3 利用聚苯乙烯所製作完成大小約5.6微米,透過不同比例的紅光與紅外光發色劑所構成100種不同顏色之微珠

圖2及圖3 利用聚苯乙烯所製作完成大小約5.6微米,透過不同比例的紅光與紅外光發色劑所構成100種不同顏色之微珠

圖4 xMAP檢測技術可依研究目的標定不同探針進行分析

圖4 xMAP檢測技術可依研究目的標定不同探針進行分析。

(二)待測樣本則以不同顏色之發色劑標定,並將標定探針之微珠與待測物在96孔微盤中進行反應。

圖5 標定探針之微珠與待測樣品之反應過程 圖6 標定探針之微珠與待測樣品之反應過程 圖7 標定探針之微珠與待測樣品之反應過程

圖5至圖7 標定探針之微珠與待測樣品之反應過程

(三)反應後,利用機器自動將反應液吸起並通過一微細管所構築之檢測通道,每次僅允許一個微珠通過檢測通道,檢測通道中設有二道雷射光,一道為紅色,一道為綠色。紅色雷射激發微珠基質中的顏色,並根據微珠中不同色彩編號及分類;綠色雷射則激發待測樣本中之顏色,當待測樣本與特定微珠之探針吸附在一起時,二道雷射所激發的光皆可被偵測到。而若樣本中不含該標的物,則僅有微珠中的激發光可被偵測到。

圖8 微珠通過檢測通道,紅色雷射激發微珠顏色,綠色雷射激發待測樣品中所標定之顏色 圖9 微珠通過檢測通道,紅色雷射激發微珠顏色,綠色雷射激發待測樣品中所標定之顏色 圖10 微珠通過檢測通道,紅色雷射激發微珠顏色,綠色雷射激發待測樣品中所標定之顏色

圖8至圖10 微珠通過檢測通道,紅色雷射激發微珠顏色,綠色雷射激發待測樣品中所標定之顏色。

(四)透過機器與電腦自動統計分析二道雷射所激發之微珠種類與數量,從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中,意即告知測試樣本中有無欲測試之病原存在,或同時存在有幾種至數十種之病原。

xMAP檢測技術之優點

  xMAP檢測技術具有下列幾項特性,也是日後推廣發展之優勢:

(一)反應快速、靈敏度高:反應環境均在液相中完成,即標定探針之微珠與待測樣本均於溶液中反應,其彼此間碰撞機率與速度相對於以往標定探針處為固相、待測樣本為液相的反應模式(如ELISA將抗體吸附於微盤中或DNA晶片將探針標定於玻璃、膜片上)理論上增加4倍以上,實際上則可增加10倍。此可大幅縮短反應時間,並有效提昇反應靈敏度。

(二)可同時檢測多種目標物,所需成本較低:本技術具有同時檢測多種病原或目標物如同生物晶片之功能,但所使用之機器設備卻遠較於DNA晶片所需購置微陣列點陣儀低廉,目前此類機器設備價格約新台幣300萬元。

(三)可多元化分析,應用性較廣:使用相同的儀器設備可針對不同之研究目的在微珠上標定上DNA探針、抗體探針或各種受體探針等從而進行不同的分析,不若DNA晶片之微陣列點陣儀般僅能使用DNA探針而較受限制。

xMAP檢測技術之應用實例

  美國研究學者Dr. Richard 等人,利用xMAP檢測技術針對100μl待測樣本中含有15種不同的細胞因子,進行精確的定量測試,其方法是將15種不同的細胞因子之抗體分別標記在15種不同顏色之微珠上,混合後加入到一個反應溶液中,並對同一樣本中的15種細胞因子進行測試,同時並用ELISA的方法,針對15種細胞因子個別進行檢測,之後針對兩組結果進行對比後分析,所得之結果大致相同,但xMAP檢測技術可在同時間完成多元之分子檢測,且靈敏度及可信度上均較高,操作也更爲簡單,在短時間即獲得所需之資料。此實例應證xMAP技術之簡便性與實用性

結語

  人類對於重大疾病或動植物有害生物診斷鑑定技術的要求,從希望針對單一種類能夠達到準確、快速與簡便三要項,逐漸轉變期待為同一時間可檢測多種仍能達到三要項,此促使DNA晶片的產生,但也因DNA晶片在應用上仍有許多限制,驅動更多研發人員開創出xMAP檢測技術。期望藉由此篇檢測技術的介紹,讓國內農業研究人員在進行檢測技術開發時能有多一項選擇,也期待國人於生活或工作上感覺不便時,能夠積極去尋覓解決之道,因為“不便”,是“開創”的原動力,從而創造新的世局。

  (本文介紹 xMAP技術所引用之相關圖片均已獲得Luminex Corporation授權使用)

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