一‧前言

　　生物晶片檢驗技術為近幾年來重要的生物技術之一，它突破以往傳統檢測技術的極限，於單一晶片上可同時檢出多種病原。微陣列型 (Microarray) 生物晶片是在晶片基質上整齊的固定、排列大量生物探針 (DNA或蛋白質)，透過DNA-DNA雜交反應或是蛋白質間特異性結合，用以進行樣品分析或檢驗。依照微陣列晶片檢測的標的物分類，則又可以分為DNA晶片與蛋白質晶片二大類，DNA晶片是以核酸分子當探針 (Probe)，用以檢測相對應的核酸片段，而DNA晶片依照點置在晶片上的探針長短，分為cDNA晶片與寡核酸晶片 (Oligonucleotide chip)。cDNA晶片最常被用於大量基因表達方面的研究，寡核苷酸晶片除了可以做基因表達的分析外，更重要是可以從事病原之診斷及基因分型 (Genotyping)。

　　關於低密度寡核酸晶片 (Low-density oligonucleotide chip) 技術應用於人類疾病病原之診斷已有多篇文獻報導，例如：人類乳頭狀瘤病毒、人類流感病毒、痘病毒、B型肝炎病毒、SARS病毒、疱疹病毒、結核桿菌、葡萄狀球菌、血液病原菌、尿液病原菌…….等病原的診斷及基因分型。但至目前為止，有關DNA晶片應用於動植物疾病病原之診斷，尚屬萌芽階段，僅有少數幾篇文獻報告。由於聚合酶連鎖反應 (PCR) 檢測方式對於病毒基因型的鑑別較難達成目標，但經由雜交反應來區分基因型別則顯得容易多了，其中又以寡核苷酸探針效果最好。而DNA晶片能被接受並能廣為推廣，除了操作簡便之外，能區別同一血清型中不同基因型 (Genotype) 之細菌或病毒是它優於傳統PCR檢測之處。

二‧ 動物疾病診斷所面臨的問題

　　當豬隻感染某種疾病後一般都會出現該種疾病特有的臨床症狀及病理解剖病灶，但近來豬隻感染某些疾病時，常因活毒疫苗的使用或病毒基因的變異等因素出現非典型病例，造成疾病診斷上的困難。另一方面，當一隻豬同時感染兩種以上的病原或該病轉變成慢性病時，此種臨床上常見的多種疾病混合感染病例，亦常造成疾病診斷上的困難。目前PCR技術應用在動物疾病的診斷上，比較於病毒分離及其它診斷方法，具有操作簡便及診斷快速之優點。但因其敏感度太高，容易產生非特異性反應，所以一般要再將PCR產物進行核酸定序或雜交反應來証實結果。而DNA晶片診斷方法即是將PCR產物再進行核酸雜交，以快速而全面性的篩檢病原基因庫，如此可以立即而正確的診斷出動物疾病為那一種病原體所感染，還可進一步鑑定感染病原的亞型或基因型。

三‧ DNA晶片診斷技術之建立

　　針對感染豬隻的重要病原，行政院農業委員會家畜衛生試驗所(畜衛所)與國內生技公司合作，將低密度寡核酸晶片技術平台與PCR或RT-PCR檢測技術進行整合，成功地建立豬隻病毒性疾病的DNA晶片診斷系統。目前本系統分成3組，一為引發豬隻水疱性疾病的整合型生物晶片，主要含口蹄疫病毒 (FMDV) 7種血清型、水疱性口炎病毒 (VSV) 4種血清型、豬水疱病病毒 (SVDV) 及豬水疱疹病毒 (VESV)。二為引發豬隻呼吸道綜合症 (PRDC) 之5種病毒及6種細菌為主的整合型生物晶片，三為豬瘟病毒 (CSFV)、牛病毒性下痢病毒 (BVDV) 及豬環狀病毒 (PCV) 為主的整合型生物晶片，主要針對豬瘟病毒中的LPC疫苗型、本土型、外來型病毒株及近親病毒BVDV與PCV中的PCV1、PCV2 等病毒株進行區別鑑定。

四‧ DNA晶片診斷技術之應用

(一)DNA晶片快速鑑別豬隻水疱性疾病 (Vesicular disease of swine)

　　豬隻水疱性疾病包括口蹄疫 (FMD)、豬水疱病.(SVD)、水疱性口炎 (VS)及豬水疱疹 (VES)等4種疾病。在動物傳染病分類上，前3種屬於甲類動物傳染病，後者屬於丙類動物傳染病。豬隻對口蹄疫、豬水疱病、水疱性口炎及豬水疱疹等病毒皆具有高度感受性，患豬口、鼻、蹄冠等部位出現水疱、潰瘍、跛腳、甚至死亡、造成重大經濟損失。目前3種重要豬隻水疱性疾病及其不同血清型別之鑑別診斷雖各有其商品化檢測套組在市場販售，但其售價甚高，亦無整合型之套組問世。畜衛所開發之水疱性疾病DNA晶片診斷系統係以甲類動物傳染病中的3種水疱性疾病及豬水疱疹等4種病毒，依其不同血清型別之核酸序列差異，設計特異性探針而成，本系統成功地區分種內 (Intra-species) 口蹄疫病毒7種血清型，包括FMDV O/Taiwan/97、O/Taiwan/99、O1/Manisa、O1/Campos、A5,、A22、C1、C3、Asia1、SAT1、SAT2及SAT3等12種亞型病毒；水疱性口炎病毒亦成功地區分VSV/Indiana 1、VSV/Indiana 2、VSV/Indiana 3及VSV/New Jersey等4種基因型(圖1 DOCX / pdf)。由於市場上尚未出現此類整合型水疱性疾病基因診斷晶片，該產品深具發展潛力並可進軍國外市場。目前將豬隻水疱性疾病快速鑑別DNA晶片應用於進口口蹄疫疫苗毒株的鑑別診斷，對於檢測口蹄疫疫苗是否混入原標識病毒株以外之其他基因型病毒，已有很好的成果。

(二)DNA晶片快速鑑別豬隻呼吸道綜合症 (Porcine respiratory disease complex；PRDC)

　　豬呼吸道綜合病症為國內保育豬與肉豬最常見之呼吸道疾病，目前該病已普遍發生於國內各養豬場。由於其發生率與死亡率很高，因而對養豬業者造成重大經濟損失。由於豬呼吸道綜合病症是由多種病毒及細菌所引起，相關之病原診斷，已有多篇關於PCR或RT-PCR診斷方法之文獻報告被發表。但尚未見到有關多引子PCR及DNA晶片之報告。有鑑於此，畜衛所發展豬隻呼吸道綜合症快速鑑別DNA晶片，經由多引子PCR及DNA晶片雜交結果顯示，可快速區別引發豬呼吸道綜合病症之5種病毒及6種細菌，進一步尚可區別豬生殖與呼吸綜合症病毒歐洲株 (PRRSV-E) 及北美株 (PRRSV-N) 兩種基因型，對於豬呼吸道冠狀病毒及豬傳染性胃腸炎病毒 (TGE) 兩種冠狀病毒也很容易區別(圖2 DOCX / pdf)。

(三)豬瘟病毒、牛病毒性下痢病毒及豬環狀病毒為主的整合型DNA晶片

　　豬瘟在傳染病分類上屬於甲類動物傳染病，以其高度傳染性及死亡率造成養豬業者重大損失。由於豬瘟病毒只有一種血清型，目前最常使用的病毒分離、免疫螢光染色法及RT-PCR診斷法，難以區別LPC疫苗毒及豬瘟野外毒。現行法規規定，小豬都必須施打LPC疫苗。而國外已有報告指出，兔化豬瘟疫苗毒在豬隻體內至少會存活12天，這期間豬隻臟器如扁桃腺、淋巴結及脾臟等淋巴組織，可被病毒分離、免疫螢光染色法、RT-PCR及酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 等方法檢出疫苗毒，因而干擾豬瘟之實驗室診斷。國內有某些專家學者曾發表文章指出，田間慢性豬瘟感染嚴重，研判極可能是LPC疫苗毒干擾了豬瘟之實驗室診斷。

　　牛病毒性下痢病毒主要感染牛隻，但也會感染豬隻，而牛病毒性下痢病毒與豬瘟病毒具有部分抗原共通性，亦會干擾豬瘟免疫螢光診斷法之判定。豬環狀病毒可分為豬第一型環狀病毒 (PCV1) 及豬第二型環狀病毒 (PCV2) 兩種病毒，其中PCV2在許多豬場之污染率相當高，是造成養豬場重大損失原因之一。本組晶片利用病毒不同基因型特異性探針與多引子RT-PCR產物進行雜交，可區別豬瘟病毒中的本土型、外來型及LPC疫苗毒3種不同基因型病毒株，與牛病毒性下痢病毒近親病毒之間亦不會造成交叉反應，而豬環狀病毒亦成功區分PCV1及PCV2兩種病毒。

五‧未來展望

　　準確、快速診斷動物疾病一直是畜衛所對於動物疾病診斷鑑定上所秉持的基本原則。由於DNA晶片診斷法是以PCR或RT-PCR反應增幅病毒核酸，得以增加檢測的敏感度，再經由核酸雜交確認可以增加檢測的準確度。取兩種技術之所長，外加呈色反應，故其敏感性及特異性皆優於單純之PCR檢測。國內PCR技術已經普及於一般實驗室，只要再加上操作簡便的核酸雜交技術，就能大幅提高疫病診斷鑑定之準確性，又能彌補PCR檢測法對於病毒基因型別鑑定上的困難。其試驗流程需先設計各病原特異性引子及不同基因型特異性探針，再將各病原不同基因型探針佈放在高分子材質之塑膠片上，製備成診斷晶片，並配製反應試劑。待檢病材經由PCR或RT-PCR增幅後將其產物與晶片上已佈放之探針進行雜交反應，未雜交物以緩衝液洗去後進行呈色反應，最後以肉眼判定結果，有呈色之反應點即判為陽性，全部檢測過程在6~7小時內完成(圖3)，不需動用貴重儀器。相較於PCR及核酸定序法 (1~2天)，符合準確、快速之原則，又可同時檢測多種病原。目前畜衛所準備將此3組晶片發展成快速診斷套組，經由與國內生技公司合作進行產品商品化以普及於一般實驗室操作。由於市場上尚未出現此類整合型晶片，該產品深具市場潛力。