前言

　　動植物疫病的診斷鑑定，通常是期望能夠達到準確、快速、簡便的要求，常運用的技術諸如聚合?連鎖反應(PCR)、酵素連結免疫吸附法（ELISA）等，該等技術通常是針對單一疫病進行診斷與鑑定，但檢測樣本有時可能潛伏感染多種疫病，反覆的測試，徒增許多人力與物力的投入，為此，多數人都期待能夠在同一時間以同一種方法檢測多種疫病，孕育而生的技術包括單管多引子聚合?連鎖反應技術（Multiplex-PCR），生技產業界所著重開發的DNA晶片、蛋白質晶片、微流體晶片、xMAP（液態晶片）等。本文將介紹近年來使用於核酸增幅之檢測技術滾環式擴增法(Rolling Circle Amplification,簡稱RCA)。

RCA法的意義與原理

　　有別於PCR技術較常使用耐高溫之DNA聚合?如Taq DNA聚合?去增幅DNA，RCA法係利用噬菌體f29之DNA聚合?(f29 DNA polymerase)來增幅DNA，此種聚合?具有DNA鏈取代作用(strand-displacement)的特性，能以樣品中具有環狀DNA之目標物(如豬環狀病毒等)為模版，於加入逢機寡核?酸引子後，在恆溫狀態下，以滾環方式迅速增幅樣品中環狀DNA，因此，如果樣品中有不同種屬環狀DNA之病原存在，其DNA可同時間被增幅出，透過電泳分析，以辨別不同種之病原。

　　RCA法之擴增原理(如圖示：)

1. 首先選取逢機寡核?酸(random oligonucleotides)作為引子，逢機與待測物中之環狀DNA進行黏合，再以f29 DNA polymerase起始DNA長鍊的合成。

    

2. 當DNA合成進行到前方的引子尾端時，f29 DNA polymerase便會發揮其DNA鏈取代作用的特性，如同鏟雪車一般的將前方的DNA鏈頂開並置換出去，進而可繼續進行其DNA複製作用。
   必須使用f29 DNA polymerase的原因係因一般常用的DNA聚合?(如DNA polymeraseIII, Klenow fragment, Taq polymerase等)並不具有(或僅有極弱的)鏈取代功能，當遇到前方DNA鏈時，便會停止作用，或將前方DNA長鏈以5’ to 3’外切?功能加以分解清除，因而無法達到增幅的效果。

    

3. 被取代置換出來的DNA鏈又可以再被逢機寡核?酸引子辨識作為模版，又開始下一輪的DNA複製。

    

4. 因為原始DNA模板是環狀，每一個逢機引子皆可不斷繞著環狀DNA模板進行滾環式DNA合成，反覆線性擴增。而其新合成的DNA又可被其他引子所合成的DNA取代出，並作為新的模板再次合成新的DNA鏈，如此反覆進行。

    

5. 全部反應溫度均在30℃恆溫下進行，不需要改變反應溫度。相對於待測病毒之DNA，植物與動物的基因體DNA為線狀，因此並不會像環狀DNA一般被迅速擴增。

    

6. 經過4~16小時的擴增反應後，以限制?(如雙生病毒基因體序列中常見的BamHI、PstI)剪切15分鐘後，即可產生大量的單位長度DNA，可以利用洋菜膠體電泳分析其圖譜。而植物與動物的基因體DNA因為並未被大量擴增，而不會顯現在洋菜膠體電泳圖譜中。

RCA法的優點

1. 使用逢機寡核?酸作為引子，不需要事先知道待測目標物的基因體序列，也不需要特別設計並合成專一性或廣效性引子對。因此特別適用於基因體序列未知、或變異性極大的病毒DNA分子。

    

2. 不需使用昂貴的溫度循環控制儀(Thermocycler)。所有反應可在恆溫30 oC下進行。大多數實驗室均已擁有恆溫反應器，而不必另行購置。

    

3. 反應操作簡便，僅需將f29 DNA polymerase、逢機引子、待測物DNA，與buffer混合，即可進行，便於開發為試劑套組。

RCA法的缺點

1. 待測物DNA必須為環狀才可以被增幅。

    

2. RCA反應時間較PCR長，需時至少4小時。反應後亦須以限制酵素剪切後，才能以洋菜膠體電泳分析。

RCA法在動植物疫病診斷上之應用：

　　如前述利用RCA法有其應用上之限制存在，因此，可以檢測之病原其核酸須為環狀DNA才能被檢測，符合此條件者如植物病毒病原之雙生病毒（Geminivirus）、矮化病毒(Nanovirus)，動物病毒性疾病如豬環狀病毒（Circovirus）等。

　　以植物雙生病毒為例，雙生病毒係透過媒介昆蟲所傳播之病原，其造成作物許多嚴重的病害，如近幾年在中南部地區番茄園所發生之番茄捲葉病Tomato leaf curl virus（TLCV）、番茄黃化捲葉病Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）；此外，在國外也有許多雙生病毒所引起之重要病害如棉花捲葉病Cotton leaf curl virus（CLCuV）、樹薯嵌紋病African cassava mosaic virus（ACMV）等。雙生病毒之病毒種類非常多，一棵作物可能同時感染許多不同種之雙生病毒，媒介昆蟲如粉蝨身上所攜帶之病毒種類可能更多，現行的雙生病毒檢測方法多依賴PCR或以血清檢測試劑方式進行，但此逐一檢測，不僅耗時，所費成本更大。加上雙生病毒單股DNA經常於植物體或粉蝨體內產生突變或重組變異種，而PCR必須使用已知特定序列的引子對，且病毒外鞘蛋白於植物體中含量極低，造成無法檢測到植物體或粉蝨體內的雙生病毒與其變異種，造成變異病毒無法檢測到而面臨潛在危害之高風險。故利用不需要特定序列引子對的滾環擴增法同時檢測植物或粉蝨體內多種雙生病毒的感染，將可大幅提升現有檢測技術之不足，且不受限於目前已知的雙生病毒種類或株系，達到真正廣效性檢測的目標。

結語

　　人類對於重大疾病或動植物有害生物診斷鑑定技術的要求，從希望針對單一種類能夠達到準確、快速與簡便三要項，逐漸轉變期待為同一時間可檢測多種仍能達到三要項，此促使DNA晶片的產生，但也因DNA晶片在應用上仍有許多限制，驅使更多研發人員開創出不同的檢測技術。期望藉由此篇檢測技術的介紹，讓國內農業研究人員在進行檢測技術開發時能有多一項選擇，也期待國人於生活或工作上感覺不便時，能夠積極去尋覓解決之道，因為“不便”是“開創”的原動力，可從而創造新的世局。

詳圖 DOCX / pdf / odt所示：雙生病毒電子顯微鏡圖、雙生病毒在蕃茄新葉上造成之捲葉病徵、媒介昆蟲－銀葉粉蝨體內可能夾帶超過5種以上之雙生病毒。