前言

　　核轉置 (Nuclear transplantation, NT) 即為大眾所熟知的動物複製技術，其概念始於 1938 年；首次將細胞核轉置成功地應用於體細胞複製動物的紀錄出現於 1952 年在兩棲類動物的研究，將取自受精卵中的胚葉細胞注入已去除染色體的未受精卵子而成功生產蝌蚪。之後，一直未再見到動物體細胞成功複製的例子。1997年，英國羅斯林研究所（Roslin Institute）利用取自 6 歲母綿羊的乳腺上皮細胞做為供核源進行核轉置，在複製 276 個羊胚後，最終獲得一隻複製羊「桃莉」，首創哺乳動物體細胞核轉置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 複製成功之例而震撼全球。桃莉的誕生，被視為二十世紀末期生物科技成就的里程碑，也是 1997 年「科學」雜誌票選為年度科學的最大突破。迄今，應用取自胎體或成體動物之體細胞而成功複製的哺乳動物，包括綿羊、牛、小鼠、山羊、豬、野牛、大鼠、貓、兔子、騾、馬、狗與狼等。動物複製技術應用在農業，可以擴大遺傳背景一致的高性能優良種畜的生產、復育與保種高度瀕臨絕種動物及基因轉置家畜的生產等用途。對於關鍵生物技術、基礎研究與組織再生的研究也具應用潛力。

動物細胞之壽命與染色體端粒長度的關係

　　正常的動物體細胞有一定壽命，在歷經多次的細胞分裂後即進入衰老期而無法再度分裂。引起細胞衰老的主要因素與染色體末端的端粒(telomere)變短有關係。端粒位於染色體末端，由短小的重複去氧核糖核酸(DNA)序列所組成。至今，許多動物的端粒已經被研究，結果發現物種間的端粒組成變異很小，甚至在演化上岐異度極大的物種亦然，例如屬於原生生物門纖毛蟲綱之單細胞生物四膜蟲 (Tetrahymena) 的端粒 DNA 序列為T(胸腺嘧啶去氧核苷,簡寫為T)-T-T-G(鳥嘌呤去氧核苷,簡寫為G)-G-G-G，而人類的端粒 DNA序列則為T-T-A(腺嘌呤去氧核苷, 簡寫為A)-G-G-G。端粒會隨著細胞分裂的次數增加而逐漸縮短，短化速率平均為一次分裂即短少20-200個鹼基對(base pair, bp)，故又稱為調控細胞壽命的‘分子時鐘’ (Mitotic clock)。端粒在細胞中對於保持染色體的穩定性與基因組的完整具有重要功能。端粒長度與細胞壽命成反比，端粒變短將使染色體容易纏黏，使細胞發生異常並步入死亡。端粒的長度，主要是受到端粒酶的調控，此酵素藉由合成新的端粒 DNA 而維持受損短化的端粒。然而，端粒酶只表現在永生的細胞株、癌細胞或生殖細胞，並不會表現在正常的體細胞。因此，端粒的長度與細胞老化間存在著密切關係。而藉由比較複製動物與正常非複製動物的染色體端粒長度，可以了解複製動物是否真的未老先衰，也能了解供核細胞在複製後能否重新活化基因組的功能，使染色體端粒長度回復正常。

染色體端粒長度的分析方法

　　染色體端粒長度的分析，可以應用端粒限制片段長度（Telomere Restriction Fragment, TRF）套組進行。其步驟是先採集動物的組織樣品或血液，萃取基因組DNA後應用限制酶加以分切，再進行膠體電氣泳動(electrophoresis)，將大小不等的DNA按分子量大小移動分開，之後應用虹吸原理，將原本存在膠體內的DNA轉漬並固定在帶正電且易於後續南方吸漬操作的尼龍膜上，再與經過螢光標定的探針(probe)進行雜合反應(hybridization)，最後在X-光片上或應用化學冷光儀截取影像並經過電腦分析軟體呈現平均端粒長度，計算出樣品的染色體端粒平均長度。

複製動物的染色體端粒長度研究

　　複製動物的成功，社會大眾關注的問題除了鎖定在可能進行複製人研究的倫理道德爭議上，也重視複製動物的健康問題。全球第一頭複製羊「桃莉」出生時，健康狀態即成為大眾關注之焦點。桃莉羊開啟體細胞複製動物的熱潮，也讓複製動物的未老先衰及染色體端粒長度成為研究的重點。1999年，參與桃莉羊研究的英國PPL公司曾檢測桃莉羊的染色體端粒長度，發現牠較同年齡非複製綿羊短少了 20%，因此，合理推測桃莉羊可能因為繼承了6歲供核母羊的端粒長度，而且在複製前該供核體細胞已經在體外培養了一段時間，故使端粒進一步變短。然而到現在，有關各種複製動物的染色體端粒長度的研究結果並不一致，分別有端粒變短、端粒正常或端粒變長等分歧結果。

　　本會畜產試驗所（以下簡稱畜試所）結合大專院校與研究機構所組成的研發團隊，應用體細胞複製技術已成功生產複製牛羊而躋身全球先進生殖科技之林。為了解這些複製牛、羊的染色體端粒長度是否與同年齡非複製動物有差異，分別採集複製牛羊與同年齡非複製動物的血液樣品，萃取基因組DNA後應用端粒限制片段長度檢測套組進行分析。結果顯示，4頭複製牛在2至 3歲時染色體平均端粒長度為 17.52 ± 0.41 kb；而 6頭同年齡非複製牛平均端粒長度為 17.53 ± 0.39 kb。複製牛在 3至 4 歲時染色體平均端粒長度 17.48 ± 0.31 kb；而6頭同年齡非複製牛之平均端粒長度為 17.80 ± 1.57 kb，兩者間無顯著差異。而做為供核之耳朵成纖維細胞之端粒長度為 17.07 kb，與複製牛比較無顯著差異。複製羊的研究結果，複製羊 1、2及 3號於 50、22 及 6 月齡的端粒長度分別為 16.68 kb、17.05 kb 及 14.32 kb；而與 3 隻複製羊相近月齡之非複製羊群的端粒長度分別為 16.92 ± 0.73 kb、17.04 ± 0.62 kb 及 17.37 ± 0.32 kb。複製羊 1、2 及 3 號在 62、34 及 18 月齡之端粒長度，分別為 12.26 kb、13.50 kb 及 10.39 kb；而與 3 隻複製羊相近月齡之非複製羊群，端粒長度分別為 16.08 ± 0.86 kb、15.72 ± 0.61 kb及 16.32 ± 0.61 kb，複製羊之端粒長度顯著較非複製羊短。

　　由此研究發現，應用複製技術生產的乳牛，其端粒長度在經過 NT操作後，供核體細胞的基因程式能再度啟動而回復端粒應有的正常長度，並未因為應用成體供核體細胞進行複製而導致端粒短化。而複製羊其端粒長度較對照非複製羊為短，且隨著月齡增加而與對照之正常羊隻為短。此結果顯示不同複製動物之端粒長度變化並不一致。複製動物的端粒長度不一致且具有高度變異性，可能與進行複製時的供核細胞種類、端粒酶基因的再程式化效率、動物的個體差異、複製的操作步驟、分析時採集到的組織或細胞種類、及動物種別的不同等因素，導致複製動物的端粒長度的差異、基因再程式化及發育潛力的差異。

結論

　　生物技術的發展在全球受到重視，主要原因在於具有重要之應用性、污染性低、技術密集及高度的經濟效益與價值。因此，世界各先進國家莫不將之列為國家生物產業之重點科技並積極研發。近年來，基因轉殖及動物複製科技已成為畜產生技領域的焦點項目；建構分子牧場，利用畜禽做為生物反應器以生產高價值醫藥用蛋白質，利用基因轉殖或標的基因替換或剔除技術建立人類基因治療之動物模式、提供器官移植所需之異種器官，改進經濟動物之生產效率，提高動物的經濟價值等，均為相當重要之研究方向。而近年來，近年，畜試所在基因轉殖畜禽與複製動物的研究領域積極投入，已成功產製了包括複製牛、複製羊、基因轉置複製羊及嵌合雞鴨等成果，顯示本所已具有研發基因轉殖畜禽或複製動物之核心技術，且累積相關的知識、經驗與動物族群。

　　有關各種複製動物是否未老先衰的問題，除了由動物的外觀，遺傳學或是各項病理學上的詳細檢測外，測定染色體的端粒長度亦可直接了解複製動物的細胞年齡。目前有關複製動物的染色體端粒研究結果並不一致。畜試所生產的複製牛羊已經完成染色體端粒長度的分析，這些複製動物也在研究人員的細心呵護下順利成長，除了外觀正常外，並能傳宗接代而順利的繁衍下一代。未來的研究重點，應積極研發改善生產效率的問題，使複製成為可以商業應用的重要關鍵技術。