一、前言

　　目前在動植物防檢疫上的診斷鑑定上，除了傳統的形態鑑定及病徵診斷外，生化、生理等技術亦被廣泛的應用，諸如酵素連結免疫吸附法（ELISA）、聚合酶連鎖反應(PCR)技術以及生物晶片(biochip)。其中，以聚合酶連鎖反應的應用最為廣泛，如逢機增幅多態型-聚合酶連鎖反應(RAPD-PCR)、聚合酶連鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)、多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)、序列特徵化增幅區域(SCARs)以及即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等。近年有一種新的生化方法--恆溫環狀擴增法(LAMP, Loop-mediated isothermal Amplification)，逐漸被應用在疫病蟲害的檢測上，反應時間雖然沒有比其它方法大量的縮短，但整體操作較為簡便，也可兼顧到準確度、敏感度的優點。

二、LAMP原理與方法

　　恆溫環狀擴增法是日本學者Notomi等人於2000年所發表的一種新的核酸分子檢測技術。LAMP技術與PCR技術主要不同之處在於前者可以在恆溫下反應，所以只需要溫度能達到60-70?a C的簡單恆溫儀器，如水浴槽(water bath)或加熱板(heat block)。 LAMP 反應需要3組引子對(primers)，分別為外引子對(outer primers)、內引子對(inner primers)以及環狀引子對(loop primers)，其中的引子對必須針對目標物序列的特異區而加以設計，這樣檢測目標物才會具有專一性。而反應中除了引子對外，尚要加入Bst DNA聚合酶，這是從一種細菌(Bacillus stearothermophilus)所純化生產的酵素，它可在一個最適溫度(60-65?a C)與上述的引子對進行聚合作用，增幅出具有自我互補能力的DNA片段，形成具有莖環(stem-loop)的啞鈴型結構，藉此連續且重複反應，產生大量的DNA片段，在反應的過程中會有焦磷酸的釋放，與反應液中的鎂離子會形成白色的焦磷酸鎂(magnesium pyrophosphate)沉澱，隨著反應時間的增加，用肉眼即可觀察到大量的白色沉澱，也就是有檢測到目標物。有時尚可加入核酸染劑溴化乙錠(ethidium bromide)或SYBR Green I，然後用UV照射來觀察反應結果，效果比直接用肉眼觀察白色沉澱更佳。

三、LAMP的特點

　　LAMP的特點大致有下列幾點：

　　(一) 不需要昂貴的儀器，只需要水浴槽或加熱器等恆溫器即可。對於某些田間檢測、偏遠地區實驗室來說，相當簡單實用。

　　(二) 因為引子對可辨識目標物6個特異性的區段，所以專一性相對提高。

　　(三) 反應時間通常只需要40~60分鐘，相較於其它大多數的技術為快，所以可以節省反應時間，在檢防疫的檢測工作上相當有利。

　　(四) 本方法的靈敏度當高，比一般PCR反應高100~1,000倍，可與Real-time PCR相差不多。

　　(五) 檢測反應所產生的白色沉澱用肉眼或濁度計即可觀察，相當簡便。若再加入核酸染劑則靈敏度則更佳。

　　(六) 只要加入反轉錄酶，對於RNA病毒或其它 RNA目標物亦可利用本方法來做檢測。

　　(七) 如果實驗室有Real-time PCR的儀器，本方法亦可搭配該儀器進行目標物「定量」的檢測。

四、 LAMP在動植物防檢疫之應用

　　目前應用LAMP在偵測植物防檢疫的例子並不多，在植物害蟲上尚未有正式的學術論文發表；而植物病害方面已有應用在馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y)、柑橘黃龍病菌(Candidatus Liberibacter spp.)等。在動物防檢疫方面則有較多應用LAMP的研究，如魚類奴卡氏菌 (fish nocardiosis)、蝦類白點症候群(shrime white spot syndrome)、犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus)等。

　　(一) 植物方面

　　西方花薊馬（Frankliniella occidentalis）原產於美洲，危害的寄主植物種類多達62科 224種以上，幼蟲及成蟲取食植物，造成花部及果實損害；雌蟲產卵於植物組織內，常造成植物無法正常生長，作物之品質及產量均受影響。80年代以後，隨著經貿往來頻繁，該蟲隨著作物擴散到世界許多國家，加上其適應性強，且為蕃茄斑點萎凋病毒(Tomato spotted wiltvirus)等病毒的主要傳播媒介，目前在許多國家都已存在並且常造成作物嚴重的危害，是台灣明令的檢疫害蟲，在機場港口進口的植物產品常常可檢測出該蟲。因為其體型小(2 mm)，幼蟲期的形態無法鑑定，分子快速鑑定就相當重要。目前防檢局與台灣大學昆蟲系合作，利用LAMP技術成功檢測西方花薊馬，其反應的靈敏性可達100毫微微克，並且經過另外50種非西方花薊馬的薊馬做對照組，結果顯示本研究的檢測專一性高，可準確鑑定西方花薊馬。

　　(二) 動物方面

　　虹彩病毒屬於魚類主要病毒性疾病之ㄧ，感染後會造成魚類全身性的感染，魚體色變黑，缺乏食慾，鰓部有貧血會呈現點狀出血的現象，解剖後可發現脾臟明顯的腫大，目前已知道可感染多種的海水魚類，包含嘉鱲、石斑、海鱺、鱸魚、虎河豚等，對於體型較大的魚具有較高的死亡率。目前防檢局與海洋大學及台灣大學合作，已開發出LAMP檢測技術，應用於石斑魚虹彩病毒之檢測，其反應的靈敏性可達10毫微微克，約為PCR反應之100至1,000倍。反應結束後，會產生白色的焦磷酸鎂沉澱，可直接以肉眼檢視反應之結果。而利用核酸染劑溴化乙烯進行染色，有反應產物的會呈粉紅色，無反應產物則是保持原本的橘色；加入溴化乙烯在紫外光下觀察，有反應物的會發出明顯之橘色螢光，無反應物的則只有背景亮光。一般實驗室常見的乾式加熱器、循環式恆溫水浴槽、雜交培養箱都可當作LAMP的反應儀器，不需要特定的儀器或設備，方便作為田間或是大量檢體之篩檢。

五、結語

　　LAMP具有快速、精準及專一等鑑定的功能，除了用簡便的水浴槽或加熱器等恆溫器外，也可用電泳跑膠來觀察其靈敏度，甚至可以搭配Real-time PCR的儀器來進行定量的分析，儀器的選擇性相當寬廣。至於能否準確檢測出目標物種，這是每一種分子鑑定方法都會遇見的問題，首先，實驗條件的設定是必須不斷的測試才能確定該項檢驗技術的穩定性，而這些技術的根本則有賴於害蟲及病原菌基因資料庫的建立與累積，在建立基因資料庫之前，生理小種(race)、分化型(forma specialis)、病原變種(pathovar)、物種(species)必須先加以鑑定釐清，免得站在錯誤的基礎上去建立分子鑑定方法。再者，基因資料庫來源的證據標本(voucher specimens)或菌株都必須妥善保存，避免日後發現先前鑑定有問題時無法再驗證。如果上述的原則能夠確實掌握住，雖然LAMP這項技術開發至今不過7年，往後應該可以應用在更多的動植物疫病蟲害的分子檢測上。