一、前言

　　口蹄疫 (FMD；foot-and-mouth diease) 為偶蹄類動物之高度傳染性病毒疾病之一，主要感染的經濟動物如牛，豬和綿羊等。口蹄疫常以高熱與口腔、舌頭、鼻鏡、蹄和乳頭部位的表皮出現水疱及破潰等症狀為特徵。口蹄疫病毒含有7種血清型，包括O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分布在全世界，每個血清型間均無交叉保護作用。在1997年台灣爆發大規模的口蹄疫。係由O型口蹄疫病毒所引起，該株病毒僅能感染豬隻 (命名為O / Taiwan / 97)。1997年爆發當時，由於採行控制及疫苗注射等相關措施，其損失總值估計超過60億美元而造成國家經濟嚴重的衝擊。1999年又於金門發現牛隻口蹄疫病毒株（命名為O / Taiwan / 99)。

　　在台灣採取口蹄疫之撲滅措施，包括：感染場清場、全面性疫苗接種及血清學檢測等，確定動物未感染野外病毒之後，終使我國於2003年5月22日經世界動物衛生組織（OIE）宣布認定為「疫苗接種之口蹄疫非疫國」。

二、技術研發

　　口蹄疫病毒感染動物後，病毒會利用宿主合成病毒外鞘之結構蛋白（SP）和非結構蛋白（NSP），而二種蛋白皆與病毒複製有關。目前全球使用在例行接種之疫苗為全病毒不活化疫苗，即以細胞培養增殖之病毒製成，所有的口蹄疫疫苗在製造生產過程中皆被嚴格要求純化處理，將NSP去除乾淨，因此注射口蹄疫疫苗的動物應只對結構性蛋白質產生抗體。而疫苗抗原純化完全可提供兩個目的，其一為冀能除去引起過敏反應的蛋白質，此外亦可除去或降低NSP在疫苗中的含量。因此預期抗原純化製備而成的疫苗將不會引發NSP抗體的產生。使得研發各種針對檢測非結構蛋白（NSP）抗體的試劑具有能力以區別自疫苗接種後所感染的動物。相當多地努力著重於發展快速而準確地檢測NSP抗體的方法及技術，且要求診斷技術須符合一致化和標準化。迄今各種檢測polyprotein 3ABC非結構蛋白抗體的診斷試驗已可成功地從疫苗接種的動物中檢測出感染病毒。NSP有些從重組的 Escherichia coli或者在適當的重組 Baculovirus轉染昆蟲細胞製造產生。為了降低偽陽性反應干擾，一種酵素連結免疫電泳轉漬法 (EITB) 當做為進一步確認的試驗方法。EITB採用的NSP有 2B、 2C、3A、3 B、3ABC和3D等，然而EITB方法在它判讀過程中非常主觀及人為錯誤的傾向，因此做為可靠的確認試驗仍有其限制。所有的試驗分析皆必須在實驗室以各種儀器設備及專業技術以完成。目前，國內使用檢測NSP的方法有美國UBI（3B）、荷蘭Ceditest（3ABC）、美國Chekit（3ABC）等3種ELISA套組，但ELISA檢測方法均需於實驗室內操作，方能予以判讀。為了方便讓第一線工作人員使用並快速獲得測試結果，因而開發免疫色層分析測試片（Chromatographic pen-side strip）快速診斷試劑套組。

三、檢測結果

　　本試驗套組針對口蹄疫病毒之非結構蛋白核酸序列設計引子，以RT-PCR方法增幅病毒核酸，經由原核系統進行基因重組、轉形作用及表現載體等方式構築而成。經771支血清樣品測試結果顯示，免疫色層分析測試片之敏感性可達96.8％及特異性可達98.8 ~100％ (附表DOCX / pdf / odt)。32頭攻毒試驗豬於感染後0、2、4、6、8、10、14、21、28、34天分別連續收集320支血清樣品，以表現口蹄疫非結構蛋白抗體之動力學。於免疫色層分析測試片及3種商品化ELISA 檢驗試劑組之陽性率變化（如下圖1），經比較發現免疫色層分析試驗片與A及B-ELISA套組最早於感染後8天檢測到NSP抗體，而C-ELISA套組需於感染後第14天才能偵測出NSP抗體，顯示C-ELISA套組敏感性較差 (如下圖2)。因此本試驗證明免疫色層分析試片有能力在口蹄疫感染後第8天即檢測到NSP抗體，此結果與商品化檢測FMD-NSP 抗體的ELISA套組結果相同，據文獻報告指出，3種ELISA試劑組檢測NSP抗體的敏感性，於感染後6個月期間就會逐漸降低。我們也曾經將免疫色層分析試片與高敏感性及高特異性的A-ELISA套組結果共同互相比對，以A-ELISA測試樣品為陽性反應結果，再與免疫色層分析測試片結果比對後，發現兩種試組測試結果有90％以上是相符，其中有7.7 ％ (n=16) 測試後小於cut off 值，亦即為陰性結果。以A-ELISA測試為陰性結果的血清，再與免疫色層分析測試片比對，兩種試劑組試結果有90％以上相符，但有1.4％ (n=8) 測試後大於cut off值，亦即為陽性結果。由以上分析結果發現差異主要於32頭攻毒試驗豬之免疫色層分析測試片與商品化ELISA檢驗試組的測試部份。此結果可能係因ELISA與免疫色層分析試驗片套組二者之反應程度無相關性，因抗體之種類不同、反應的特異性及試驗過程等不同也會造成結果不一致。或者是在不同表現系統中之多胜肽 (polypeptides) 產生蛋白質結構差異所造成的部分結果亦不相同。因此應考慮飼養場疫病流行實況及或者使用另外的試驗方法予以証明疑似樣品。

四、檢測套組之應用及開發潛力

　　為了開發一套口蹄疫免疫色層分析測試片檢驗套組，利用生物遺傳工程之先進技術製成，以NSP重組蛋白作為抗原基質，其優點就是可量產出具功能性之可溶性重組蛋白，無活病毒存在之慮，且易於量產純化以獲得高濃度蛋白。此基於安全考量的設計原理，而無慮病原再活化之風險，因此為一套符合具快速、簡便、敏感、安定及特異性兼具之產品。本試劑套組係利用免疫色層分析原理設計，其優點為操作簡便，不需仰賴儀器，只要一滴血清即可在15~20分鐘快速完成定性檢測，另配合已商品化之手攜式口袋型POCT 檢測器可於50分鐘內完成血清中的口蹄疫NSP抗體之定量檢測(如下圖3)。本免疫色層分析試驗片亦曾送至美國農業部梅島海外疾病診斷中心 (FADDL-Plum island) 及荷蘭國家動物衛生研究所 (CIDC-Lelystad) 測試均證實，可同時檢測口蹄疫O、A、C、Asia 1等4種血清型別，且不會與豬水疱病抗血清產生非特異性反應。預期國內停止口蹄疫疫苗接種並申請步入非疫國之後，可提供防疫單位協助養豬業者迅速得知豬隻是否感染病原的檢測方法尤其是在疑似水泡性疾病病例的診斷上有相當大的助益，非常適合第一線的現場防疫人員及實驗室供為監測使用。除此之外，免疫色層分析測試片也可應用推廣至國外，以建立一個疾病診斷的新模式，往後甚至可以將本研發技術廣泛地應用於其他動物傳染病之診斷，以供作國內外疾病發生場由防疫人員及實驗室例行性疾病檢診服務之最快速而理想的診斷工具。

　　
圖2　口蹄疫陽性血清樣品分別以免疫色層分析測試片及商品化ELISA試劑套組 (A、B、C) 比較測試結果，本測試片可於感染後第8天檢出NSP抗體，而於第14天達到最高峰，抗體出現可長達至34天以上

圖3　利用免疫色層分析測試片配合就地醫護檢測器 (point of care testing；POCT) 可快速定量檢測口蹄疫非結構蛋白 (NSP) 抗體