水產試驗所 張錦宜、吳嘉哲、林金榮

前言

如何快速準確地檢測和診斷水產動物疾病，是未來水產養殖健康管理的主要成敗關鍵。依照傳統微生物方法，從檢體中分離、純化、培養疑似病原菌，再根據菌種之生理生化特性加以鑑定種類，曠日費時，至少需 1 周，而且，若遇特別難培養的細菌 ( 如 Streptococcus spp.) 或生長速度極慢的菌種 ( 如 Nocardia spp.) ，則更為耗時。 水產養殖疫病的快速蔓延，往往是因為水源被鄰近污染物，或自家養殖場的排放廢水汙染而不自知。在這種狀況下，水中細菌數量的高低，即能相當真實地反映出水質的潔淨程度。惟一般標準流程的水質總生菌數檢測耗時至少 3 天，而且必須由訓練有素的技術人員，在特定的實驗室中以專業的設備為之；研究單位習以為常的檢測工作，對養殖業者或一般社會大眾而言，卻有著難以跨越的技術鴻溝，造成許多奠基於現場檢測結果發展出來的健康管理原則，往往只能流於空談。

在這個生物技術蓬勃發展的時代，疾病快速檢驗套組的開發成為科學家競逐的新戰場，除了稍早已廣泛使用的血清學技術（包括：單 ( 多 ) 株抗體檢測、免疫螢光技術、西方氏點墨法、 ELISA 等），近年來更加入了核酸雜交技術、聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 技術、 DNA 指紋技術、 16S rRNA 檢測技術以及結合分子生物學與免疫學的免疫 PCR 和 PCR-ELISA 等，不僅提高靈敏度，更大幅縮短了檢測所需時間。然而，對於絕大多數以家庭或小農型態經營的台灣養殖業而言，這些先進的研究不過是空中樓閣，他們沒有多餘的資金成立實驗室，更僱不起專業的技術人員來操作那些昂貴又複雜的儀器，究竟什麼樣的工具，才是養殖業者在現場防疫前線最簡單、好用、且最迫切需要的呢？

有鑑於此，本會水產試驗所經過仔細評估，持續研發出一系列可以由養殖業者，或一般普羅大眾自行檢測細菌的防疫及衛生管理工具 ― 「一點靈」簡單試劑 ( Easy kit) 。其特色為（ 1 ）簡易：不會超出 3 個步驟、人人會使用、不須附加儀器設備（ 2 ）快速： 24 小時內呈現反應結果（ 3 ）清楚：結果以肉眼判讀、一目了然（ 4 ）方便：適合在現場操作、不怕污染。（ 5 ）便宜：採用最低成本設計，符合經濟效益，不會造成養殖業者的負擔。目前已有 3 種產品開發完成，詳述如下：

愛德華氏菌快速檢測套組 (E-kit)

愛德華氏菌 ( Edwardsiella tarda) 是台灣養殖鰻魚的主要病原菌之一，會造成鰻魚下痢、皮下及內臟出血、肝腎腫大潰瘍等程度不一的症狀，屬腸炎型系統性疾病，全身各組織臟器都會遭細菌侵入，死亡率常在 5 0 ％ 以上。除鰻魚外，亦會造成其他淡水養殖種類 （如鮭、鱒、鯉、鯰、吳郭魚、比目魚等）類似症狀的潰瘍症。

E-kit （外觀如圖 1 ）首創由養殖業者自行監測病原菌數量及評估危險指數的健康管理模式。其使用方法非常簡單，只要取用魚池裡的一滴水（圖 2 ），或者將不明原因死亡、或奄奄一息的鰻魚剖開，用一根乾淨牙籤穿刺一下（圖 3 ），就完成了所有的檢測動作。接下來，在 12~18 小時之內，若試劑由綠色轉為全黑色（圖 1 ），即為「 + 」反應（代表檢體中有愛德華氏菌），不僅如此，還可依「 + 」反應出現的時間，判斷 E. tarda 的生菌數及池魚大量死亡的危險指數，並推知發生大規模傳染的風險指數 ( 表 1) ；這些結果，都只要用肉眼就可以判讀，完全不需要輔助儀器，而且相當靈敏，每 1 c .c. 樣本中愛德華氏菌只要超過 10 個，就可以被檢測出來。使用本套組，可每日監測養殖環境中病原菌的數量變化，並可依表 1 建議採取適當的預防措施。此外，亦可結合安全養殖的觀念，使 E-kit 融入日常健康管理措施之中 ( 圖 4 ) ，可在病原菌大量繁殖前的 24 小時黃金時間獲得足夠的警訊，將疾病發生的風險降到最低。正確使用本套組，配合適當的養殖管理，預估可減少 5 0 ％ 以上的用藥成本，更可大幅增加養殖鰻之活存率。

溶藻弧菌快速檢測套組 (VA-kit)

溶藻弧菌 ( Vibrio alginolyticus) 廣泛分布於世界各地海水及河口處，是海洋中正常菌群之一，亦是多種水產生物的條件致病菌。其感染的養殖種類曾載於文獻的包括海水魚 ( 黑鯛、黃鰭鯛、大黃魚、石斑 ) 、蝦 ( 草蝦、斑節蝦、白蝦、中國對蝦 ) 及貝類 ( 文蛤、九孔 ) 等，往往導致業者極大的損失。此外，生鮮海產中若帶有大量溶藻弧菌亦會引起人類食物中毒，故其為水產養殖及食品衛生管理上重要的病原菌。

水產試驗所所開發出的 VA-kit 在使用上與 E-kit 一樣方便，其 原型為體積約 150µl 之液狀試劑，檢測時僅需滴加 40µl 之檢體，於 40 ℃ 反應 6 ~ 24 小時即可以肉眼判讀，若試劑從無色變為藍紫色 ( 圖 5 ) ，則表示檢體中有溶藻弧菌。此外，本套組亦能根據呈色反應的時間，推定檢體中溶藻弧菌的數量。若檢體中溶藻弧菌的數量 > 10 ⁸ CFU/m l ， VA-kit 會在 6 小時以內變色；若介於 10 ⁵ ~ 10 ⁸ C FU/m l ，變色時間為 12 小時以內；介於 10 ² ~ 10 ⁵ C FU/m l ，則 VA-kit 會在 24 小時以內變色 ( 圖 6 ) 。

水質總生菌數檢測套組 (TVBC-kit)

總生菌數 (Total viable bacteria count) 傳統上作為一種衛生指標，可顯示水中、生鮮食品或其他環境樣品受污染的程度。樣品中總生菌數的含量若超過規定標準，則代表水源、液體或食品來源受到污染，或者在生產過程中的某個階段的衛生條件不合格。此外，養殖業者的進水水源，往往受到自家或附近業者的排放水汙染，造成水產疫病的快速蔓延，水質總生菌數的自主檢測亦可作為養殖用水水源管理的重要參考。

水產試驗所開發出一個可以完全由一般消費者操作、自行檢測各種樣本中總生菌數量的簡易套組。使用時以吸管取檢體，分別添加 1 滴於試劑 A 與試劑 B 中 ( 圖 7 -a) ，將含試劑 B 與檢體之容器劇烈搖晃充分混合後 ( 圖 7 -b) ， 再以另一吸管取此混合液，添加 1 滴 於試劑 C 中 ( 圖 7 -c) 。觀察試劑 A 及 C 於 35 ℃ 中， 12 小時以後的顏色變化 ( 圖 7 -d) ，若 A 與 C 同時變色表示檢體中生菌數過高，不符合衛生標準。 目前開發出 3 種商品原型，可 適用於不同的場合： 檢測標準為 10 ⁵ C FU/ml 的 TVBC-100000 適用於檢測養殖場水源是否遭受汙染、並能協助鮮食料理之衛生管理及賣場冰品之衛生控管等； 檢測標準為 500 C FU/ml 的 TVBC-500 適用於溫泉、游泳池及休閒商用水業者之定期自我評鑑； 檢測標準為 100 C FU/ml 的 TVBC-100 適用於學校、公寓、大樓水塔、自來水及飲用水之使用者自主管理。

結論

本會水產試驗所近年來在陸續開發完成的 Easy kit 系列產品，均可準確地檢測出病原菌，並推估出檢體中病原菌或總生菌數量。又因為不需使用到繁雜的技巧或特殊的儀器設備，故適合實際應用於養殖現場之疾病監控，及協助 小商家與一般消費大眾做好自主衛生管理的工作 。若能 善用此一友善的細菌檢測工具， 對每一標的物均能建立長期連續的監測紀錄，如此，當檢體中細菌數量異常增加時，即可在第一時間做最適當的處理，真正落實「預防勝於治療」、「防患於未然」的健康管理原則。